类器官技术及其对消化系统肿瘤的临床应用.docx

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1、一、引言人类的消化系统主要由口腔、食道、胃肠道，以及唾液腺、肝脏、胰腺等辅助器官组成。起源于消化道和辅助器官的消化系统肿瘤是目前最常见的癌症类型,包括食管癌、胃癌、结直肠癌(CRC),肝癌和胰腺癌。其中，食管癌、胃癌、结直肠癌的发病率在全球恶性肿瘤中分别排在第八、第五、第三位。胃癌和结直肠癌分别是全球第三大和第二大癌症相关死亡原因。此外，肝癌和胰腺癌因确诊较晚且对治疗反应有限，是最致命的恶性肿瘤。总的来说，这些消化系统肿瘤占人类癌症发病率的25%以上，占癌症相关死亡原因的35%。因此，临床上亟需为这些癌症制定更加有效的治疗策略。然而，开发新的治疗方法的主要障碍之一是缺乏能够很好地再现患者肿瘤特

2、征的癌症模型。以往人们通过各种模型对消化系统肿瘤的发病机制和治疗策略进行了大量的研究。目前，患者来源的肿瘤细胞系(PDC)和肿瘤异种移植(PDX)是最常用的肿瘤模型。二维培养的PDC因缺乏肿瘤结构和微环境的特点，限制了其在临床前研究中的应用。虽然与PDC相比，PDX可以更好地模拟人类肿瘤生物学特性，但也存在成功率低、周期长等缺点。近年来，三维(3D)培养技术已经被用于开发新的和更接近人类生理的癌症模型。值得一提的是，SatO等利用单个1.GR5+的干细胞成功建立了3D肠道隐管-绒毛结构，称为肠类器官。这项研究为其他消化系统类器官的建立奠定了基础。目前为止，研究者己经建立了大多数消化系统的类器官

3、，包括结肠、肝脏、胰腺、胃、唾液腺、食道。这些3D培养的类器官模拟了原始组织的组织学和遗传学特征，比PDC和PDX具有更多优势。因此，类器官已成为消化系统肿瘤研究的理想模型。本文中，我们讨论了类器官的建立方法及其在基础和转化研究中的应用。二、消化系统类器官的建立(一)类器官的细胞来源理论上，类器官可以从含有干细胞的组织或结构中生成。目前，建立正常类器官的细胞来源包括多能干细胞(plurpotentstemcells,PSC)和成体干细胞(adultstemcells,ASC)(图1)。成体干细胞广泛存在于各种组织类型中，负责组织维护和损伤修复。例如，研究表明1.GR5可作为各种消化道上皮细胞的

4、干细胞标记物。在多种生长因子和其他刺激存在的情况下，组织来源的成体干细胞可以在3D基质中高效地生长为类器官。两种PSC胚胎干细胞(ESC)和诱导多能干细胞(iPSC)一一可以用来建立类器官。由于人类ESC既不方便获取也不符合伦理要求，在这里不作讨论。iPSC具有自我更新和分化的能力，己被广泛应用于正常的类器官构建。由于癌症类型和致癌突变的差异，不同患者来源的iPSC生成肿瘤类器官的效率不同。因此，iPSC来源的类器官通常需要选择性地培养为特定亚型，缺乏原始肿瘤的遗传异质性。图1.消化系统类器官的构建。（二）一般步骤从小鼠和人类成体组织中构建消化系统类器官的方法已经有大量研究报道。这里将大致步骤

5、总结如下。首先，采集标本后，去除肌肉、结缔组织等多余组织。然后，将组织剪碎，并在温和的蛋白酶，如胶原酶或中性蛋白酶中进行消化。对于表达特异性干细胞标记物的单个干细胞，可以通过流式细胞术进行分选。接下来，将消化后的混合细胞或干细胞悬液包裹于3D细胞外基质（如MatrigeI）,该基质能够帮助细胞分化和进行空间组织，使其成为具有功能的类器官。Matrigel凝固后，加入含多种生长因子、分化因子和细胞因子的类器官培养基。每35天更换一次培养基，单细胞一般可在1周内形成3D类器官结构。这些类器官可以进行连续传代和冻存，同时保持其形态特征和基因组稳定性。PSC产生类器官的过程是紧密模仿胚胎发育的过程。该

6、过程通常包括三个步骤：胚层诱导、组织特异性球体形成和类器官特化。由于消化系统均由内胚层来源的组织构成，因此内胚层形成对消化系统类器官的建成至关重要。在这一过程中，激活素A和骨形态发生蛋白4（BMP4）被用来诱导最终内胚层形成；然后添加一组生长因子来诱导前肠（WNT3A、FGF4、NOGGIN）或中/后肠（WNT3A、FGF4)分化。此外，在最后一天添加视黄酸，以诱导前肠内胚层的后续分化。经过以上处理，24天内可以观察到漂浮的3D球体的形成。最后，将球体重悬于Matrigel中，覆盖相应的类器官培养基。(三)消化系统类器官的培养体系类器官培养体系由类器官培养基和细胞外基质(ECM)组成。该体系模

7、拟了体内干细胞自我更新的微环境，支持干细胞的体外扩张和3D组织。类器官培养基由各种生长因子、分化刺激因子和小分子化合物构成，是成功建立类器官的关键。所有的类器官培养基的基础成分一般包含：advancedDMEM/F12、青霉素/链霉素、HEPES、GlutaMAXN2、B27、烟酰胺、N-乙酰半胱氨酸以及其他生长因子和抑制剂。尽管不同消化系统类器官的干细胞微环境的组成存在差异，但以下因子对大多数消化系统类器官的培养是必不可少的，包括受体酪氨酸激酶配体(EGF和FGFIO)、Wnt激动剂(WNT3A和R-SPondin)、BMP抑制剂(NoGGIN)和转化生长因子(TGF)-B抑制剂。此外，根据

8、组织来源还需添加其他因子或抑制剂以促进类器官的扩增(表1)。表1消化系统类器官培养基成分THSUecyPeSourceECFNOGCINR-ondinIWNnACMhnFGHoNkotifwmkkAnglY276)2SB202I90FCORvtonHGFmedium(mml,)(nsm1.,)(ngm1.l)(ngmt,)(nxI1.)(nsml,)(mmolI,)(nI1.,)(mol1.,)(mol1.,)(MnoI1.l)(mol1.,)(ngmt,)EsopMsIMouse50.010-10?io.,IO-0,IJOIO5Momich(tlHunwn50.0IOXCMIOXCMSOXC

9、M1-010,SnwllUKttfIiwI6Human50.0IQ-10,IQIO1to-0,IQ.IO,CotaIQlHunwn20.0IQ-10,IQ-IQ,50CMIjO.10,1.ffVff8HunwnS0.02SQIOXCM3OXCIPMMM191HUflWn50.0IMCMI(AGM(ncMIjO-10,由于Wnt信号在维持消化道干细胞活性中发挥重要作用，因此所有消化系统类器官培养基中均含有WNT3A和R-Spondino研究证明BMP信号通过抑制Wnt-catenin信号通路来抑制肠道干细胞的自我更新，因而BMP的拮抗蛋白是干细胞长期维持所必需的。表皮生长因子EGF与上皮细胞的增

10、殖相关，是培养基的另一个重要组成部分。FGFlo被证明在消化道发育过程中可促进细胞增殖、抑制分化，因此，其在胃、肝脏、胰腺类器官的培养中是必要的。胃泌素能促进胃细胞增殖,在大多数消化系统类器官的培养基中也是必需的。除以上生长因子外,类器官培养还需添加一组小分子化合物。Rho激酶抑制剂Y-27632可有效抑制单个干细胞的失巢凋亡，是有效建立肝脏类器官所必需的。烟酰胺也称为维生素B3,被证明可以抑制乙酰化酶SirtUinS的活性，促进人结肠类器官的形成。研究证明TGF-B信号通路可抑制结肠上皮细胞增殖，促进细胞凋亡和分化，因而在类器官培养基中加入TGF-抑制剂A83-01以提高构建效率。P38抑制

11、剂SB202190被发现可以提高接种效率，促进人结肠类器官的连续传代。据报道，前列腺素E2(PGE2)可防止脱离诱导的细胞死亡和激活经典的Wnt信号通路，并被发现对人消化系统干细胞增殖是必要的。与二维培养系统不同，类器官培养需要ECM来辅助形成类似器官结构的空间排列和3D模式。ECM由大量具有不同物理和生化性质的成分组成，包括糖蛋白、蛋白多糖和多糖等。从小鼠肉瘤中提取的Matrigel是目前类器官培养体系中应用最广泛的ECMCMatrigel由多种细胞外基质蛋白组成，如胶原蛋白、层黏连蛋白、硫酸肝素蛋白聚糖等，能够为体外培养的细胞提供生理环境。(四)类器官鉴定标准目前，对于类器官的鉴定没有统一

12、的标准。总结现有文献，鉴定类器官的通用标准是保留原始组织的形态和遗传特征。首先，类器官需具备起源组织的组织病理学特征，这些可以通过苏木精-伊红(H&E)染色和免疫染色等组织学分析来识别。例如，肝脏类器官可以通过肝细胞标志物A1.B和HePParl来鉴别，胆管细胞类器官可以通过KRT19胆道标志物来鉴别。类器官还应保持起源组织的遗传特征,可以通过基因组和转录组测序等方法进行分析。我们相信,在以后的研究中，功能表征也应该成为鉴定类器官的一个必要标准。真实的器官功能再现能够实现类器官在再生医学中的应用。例如，在最近一项令人振奋的研究中，Sampaziotis等建立的胆管细胞类器官可在移植后修复人胆管

13、上皮。三、消化系统肿瘤类器官的建立正常消化系统类器官培养方法已成功应用于患者肿瘤组织来源的类器官培养。迄今为止,研究者己经成功建立了多种消化系统肿瘤患者来源的肿瘤类器官,包括食道、胃、小肠、结肠、肝脏和胰腺。一般来说，可以通过手术切除或活检获取肿瘤组织，建立肿瘤类器官。大部分肿瘤类器官的培养基成分与对应的正常类器官的培养基成分相同。然而，根据肿瘤样本特定的突变背景和异常激活通路,在缺失某些特定因子的情况下，消化系统肿瘤类器官通常能够更有效地生长。食管癌可分为食管腺癌(EAC)和食管鳞状细胞癌(ESCC)两种亚型。已有研究成功从人EAC和ESCC组织中建立了食管肿瘤类器官。1.i等构建了EAC患

14、者来源的类器官，再现了EAC的形态、转录组和基因组特征。Kijima等利用小鼠食管类器官的培养基配方，从ESCC患者的活检组织中同时建立了肿瘤和非肿瘤类器官。多项研究发现，在最优的培养条件下，正常类器官往往比肿瘤类器官生长更旺盛，这可能与肿瘤类器官基因组不稳定及其导致的细胞凋亡有关。因此，可以通过对培养基进行调整，添加或去除某些因子，以促进肿瘤类器官的生长，抑制非肿瘤类器官的过度生长。例如，建立胃癌类器官时，若八PC基因突变导致Wnt信号异常激活，则不需要加入WNT3A；若为RAS/MAPK信号通路突变，则不需要加入EGF；若有TGF-信号通路突变则不需要加入A83-01o结直肠癌是一种高度异

15、质性肿瘤，不同患者的遗传改变、临床表现和预后各异。据报道，结直肠癌最常见的突变信号通路包括WnhRASMAPKPI3K、TGF和TP53信号。因此，研究人员利用不同亚型对培养因子需求的差异，有选择地扩增结直肠肿瘤类器官。Fujii等从不同组织学亚型和临床分期的患者组织中建立了一系列结直肠肿瘤类器官。通过转录组分析对这些类器官进行鉴别，并根据对因子的不同需求进行选择培养。他们还证明，这些类器官能够很好地模拟原始肿瘤组织的组织病理分级和分化程度。研究者通过使用特定的分离和扩增培养基，成功构建了原发性肝癌包括肝细胞癌（HCC）、胆管癌（CC）和混合癌（CHC）的类器官。值得注意的是，为了避免非肿瘤类器官的生长，BroUtier等调整了正常肝脏类器官的构建方法：延长组织消化时间；调整培养基成分，去除R-SPondin1、NOGGIN和WNT3A,添加地塞米松和RhO激酶抑制剂。如上文提到，类器官也可从iPSC中获得，己有几项研究报道了利用iPSC建立肝脏肿瘤类器官。例如，Sun等利用重编程的人肝脏细胞进行TP53、RB的失活，建立了肝脏类器官，然后通过基因过表达致癌基因C-Myc和RAS建立肝癌类器官模型。多个研究团队已经成功建立了胰腺癌类器官。与肝脏肿瘤类器官相似，胰腺癌类器官可以从不同来源获得。手术切除的肿瘤组织是胰腺癌类