关于PAR-2基因在EBV转化人胃上皮细胞中的作用.docx

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1、关于PAR2基因在EBV转化人胃上皮细胞中的作用刘换新陈娟刘梅叶春【摘要】目的研究EBV感染人胃上皮细胞系GFS-I后PAR-2基因的表达状况及转化作用，以探讨PAR-2基因在EPStein-Baar病毒(EBV)相关胃癌发生中所起的作用。方法用携带NEO基因的重组EBV产生细胞系Akata1061以密切接触法感染人胃上皮细胞系GF5-1,采用脂质体介导法将PAR-2基因转染至同一细胞，以pcDNA3空载体质粒转染同一细胞为对照;经G418筛选获得感染或转染的抗性细胞克隆;采用免疫细胞化学法测定EBNAl的表达以鉴定EBV感染细胞克隆，测定EBV感染和PAR-2基因转染细胞中PAR-2蛋白的表

2、达;通过形态学观察、细胞生长曲线测定及流式细胞分析等方法观察细胞生物学特性的变化。结果与对照组相比，EBV感染及PAR-2转染后细胞发生明显的形态学变化，生长速度明显加快，S期细胞比例显著提高，分别为(70.350.91)%(60.673.06)%和(34.741.03)%,差异有显著性(P0.05),表明EBV感染及PAR-2基因转染均使细胞增殖加快。结论EBV感染及PAR-2基因转染可使人胃上皮细胞的增殖速度加快，细胞恶性程度增强，但并未导致肿瘤的发生。EBV对人胃上皮细胞的转化作用可能与PAR-2基因的过度表达有关。【关键词】Epstein-Barr病毒(EBV);PAR-2;人胃上皮细

3、胞;基因转染;细胞周期RoleofPAR-2geneinEBV-transformedhumangastricepititelialcells1.IUHuan-xin,CHENJuan,1.IUMei,etal.TheHospitalofArmedPoliceofGuangdong,Guangzhou510507,ChinaAbstractObjectiveTodefinetheroleofPAR-2geneinthecarcinogenesisofEBV-associatedgastriccarcinoma,weexaminedtheexpressionofPAR-2inthehumanep

4、ithelialcelllineGESlinfectedwithEBVandtestedifEBVcouldinducecelltransformation.MethodsAkata1061wasusedtoinfectGES-Itheintimatecontactmeth-od.pcDNA3-PAR-2washansfectedintocellstheUpofectAMINEmethod,whereaspcDNA3vectorwasusedasthecontrol.Geneticin418(G418)wasadoptedtoselectpositiveclonesthatwereeither

5、EBVorPAR-2positive.Immuno-histochemicalstainingmethodwasusedtodetectEBNAIexpressionincellclonesinfectedwithEBVandtheepressionofPAR-2proteininEBV-infectedorPAR-2-transfectedcellclones.Morphologicalobservations,cellgrowthcurvede-terminations,softagargelformationtests,andflowcytometrywereemployedtomeas

6、urechangesincellproliferationandcellcycleProgress.ResuItsComparedtothecontrol,EBV-infectedorPAR-2-transfectedcellsrevealedsignificantmorphologicalchangesthatwereaccompaniedasignificantincreaseinthecellgrowthvelocity.ThenumbersofSasecellsweresignificantlyincreased(P0.05),bothEBV-infection(70.350.91%)

7、andPAR-2-transfection(60.67%3.06%),comparedtothecontrol(34.74%1.03%),Cellcolonyformationwasnotdetectedthesoftagargelcloneformationtest.ConclusionBothEBVinfectionandPAR-2transfectionpromotetheproliferationofgastricepithelialcellsresultinanincreasedtendencyofmalignance.However,thebotheventsfailedtoind

8、ucecarcinoma.Thesedatasuggestthatanover-expressionofPAR-2mayplayaroleinEBVinducedtransformationonhumangastricepithelialcells.KeywordsEpstein-Barrvirus(EBV);PAR-2;Humangastricepithelialcell;Genetransfection;Cellcycle胃癌是我国最常见的消化道恶性肿瘤，发病率在世界范围内的恶性肿瘤中占第二位，其发病机制目前并不十分清楚。大多数学者认为,胃癌的发生是物理、化学、生物等多因素、多阶段的发展过

9、程。1990年BUrke等1首次报道了1例EBV阳性胃癌，自此EBV感染与胃癌的关系受到关注2。EBV最初是由Epstein和Barr从非洲伯基特淋巴瘤(B1.)培养中发现的，它与多种人类肿瘤有关。目前，对EBV相关胃癌的研究主要在临床病理方面，而EBV感染后胃上皮细胞变化的分子机制尚不明确。笔者采用EBV感染和PAR-2基因转染体外培养的胃上皮细胞系GES-I,对比分析细胞生物学特性的变化，从而探讨PAR-2基因在EBV致胃癌发生发展中的作用。1材料与方法1.1 主要试剂脂质体1.iPOfeCtAMINETM2000regent,G418购自Invitrogen公司;小量质粒提取试剂盒、限制

10、性内切酶、XDNA/Hindmmaker,200byDNAStePIadder、琼脂糖购自华美生物技术工程公司;RPMlI640培养基购自美国GibCO公司;胎牛血清(FCS)购自基因公司;免疫细胞化学染色试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司;胃癌病人血清为来自本院肿瘤科;载体和细胞株：pcDNA3空载体质粒、PCDNA3-c-myC重组质粒及携带NEW基因的重组EBV产生细胞系Akata1061均为广州安必平生物科技有限公司提供;人胃上皮细胞系GFS-I由南方医科大学肿瘤研究所提供;大肠杆菌HB101由安必平生物科技有限公司提供。1.2 细胞的培养人胃上皮细胞系GES-I用含10%FCS,

11、100ml青霉素、100U/ml链霉素的RPMI1640培养基，置于370,5%C02培养箱中培养。细胞23天换1次液，细胞融合约达80%时，以0.25%胰蛋白酶消化传代。Akata细胞为悬浮生长的淋巴细胞，具有G418抗性。常规悬浮细胞培养方法，另含700mg1.G41801.3 pcDNA3-PAR-2重组质粒及pcDNA3空载体质粒的获得取感受态的大肠杆菌，按质粒小量提取方法进行质粒DNA的提取和纯化，用BamHI酶切后电泳鉴定，用Quantityone图像分析软件进行灰度测定，计算提取质粒的浓度，并根据此浓度确定转染所需的量。1.4 基因转染及阳性克隆筛选将pcDNA3-c-myc重组

12、质粒及pcDNA3空载体质粒按1：21：3的量用脂质体法分别转染24孔板中90%93%融合的GES-I细胞,按试剂盒操作手册进行。37转染5h后，加人FCS至终浓度10%。48h后用有限稀释法进行阳性克隆，并置于含300mg1.G418（根据预实验结果而定）的选择培养基中，筛选培养2周，待抗性单克隆长至足够大，挑取单克隆集落，扩大培养，制备细胞片。EBV感染及阳性克隆筛选：感染前3天，Akatal061细胞稀释至2103ml,加入终浓度为0.5%山羊抗人降解血清，于37团培养2h,不时轻轻摇动，然后以PBS洗2次，以含10%FCS的RPMI1640培养基继续培养。感染前1天，将GES-I细胞以

13、2mmol1.EIYI,APBS消化下来，置于12孔培养板中，每孔2ml培养基，含5x103细胞。转染当天更换等体积培养基。转染时每孔加人ImlAkata细胞悬液,于370,5%CO2培养箱中共同培养3天。在第2天更新一半培养基，使FCS浓度降至5%。此过程结束后，以PBS洗4次，加人2ml含10%FCS的培养基。感染后第5天,将细胞消化下来，稀释至2102ml,接种于96孔板中培养至克隆形成。此过程中，培养基中加入终浓度为300mmol1.的G418和终浓度为lmmol1.的更昔洛韦（仅第1周）。将所获得的细胞克隆常规培养并制备细胞片。1.5 EBNAI及PAR-2蛋白的检测将EBV感染细胞

14、片用FTIC标记的免疫细胞化学方法检测EBNAI的表达;感染和转染细胞片检测PAR-2蛋白的表达。免疫细胞化学检测方法按说明书操作，以PBS代替一抗作为阴性对照，以细胞内出现明确亮绿色判定为阳性结果。1.6 细胞生长曲线测定取EBV感染、c-myc基因转染及对照细胞培养至对数生长期，用0.25%胰酶消化制成单细胞悬液，经计数后以3103个/孔接种于24孔板，每孔加人无血清培养基2ml培养1天使细胞同步化，换入含10%FCS的RPMI1640培养基2ml继续培养。每天取4孔进行细胞计数，每孔重复计数3次，取其平均值，连续计数7天，以时间为横坐标，细胞数为纵坐标绘制细胞生长曲线。1.7 软琼脂克隆

15、形成试验在6孔细胞培养板中,每孔先加入0.66%底层琼脂3ml（1.5ml1.3%琼脂冷却至55团左右，与1.5ml预温的370含2RPMI1640培养基混匀），待凝固后，加入0.33%的含细胞的上层琼脂3ml,每组细胞均做复孔。置湿盒，在37团，5%CO2及饱和湿度环境下培养23周，观察软琼脂中细胞集落的形成。1.8 细胞周期的测定分别收集各组细胞，经0.25%胰酶消化，离心收集细胞，冷PBS洗涤2次。加入预冷的70%酒精，4团固定过夜。8001000g离心弃上清，冷PBS离心洗涤2次并重悬，制成单细胞悬液，注意离心速度不宜过快。等体积细胞悬液和碘化丙咤（PI）染液混合,4团放置20min3

16、00目尼龙过滤,加样入流式细胞分析仪样品室，进行细胞周期检测。1.9 统计学处理采用SPSS13.0统计分析软件对数据进行单因素方差分析。设定P005为差异有显著性。2结果2.1 PWNA3-PAR-2重组质粒的鉴定扩增纯化的pcDNA3-PAR-2重组质粒经BamH团酶切、电泳，可见PAR-2基因大小为1.3kb,pcDNA3载体为5.4kb,恰好在pcDNA3的与所提供的质粒图谱相符（图1）和PAR-2蛋白表达,转染了PAR-2基因的GES-I细胞有PAR-2蛋白表达，细胞均被染成亮绿色，阳性结果主要出现在细胞核，部分在细胞质，而空载体转染组及正常GES1细胞均为阴性（图2、图3）。2.2 细胞形态学变化正常的GES-I细胞呈短梭形,大小较为一致，核较小呈圆形或椭圆形;感染及转染组细胞体积变大，呈椭圆形或多角形，核变大，核浆比增大，折光性增强，与正常GES-I细胞相比较，细胞增殖迅速，细胞生长的接触性抑制不明显，