Ghrelin对重症急性胰腺炎大鼠胃肠运动影响及机制探究.docx

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1、GhreHn对重症急性胰腺炎大鼠胃肠运动影响及机制探究1Ghrelin对重症急性胰腺炎大鼠胃肠运动影响及机制探究GhreIin对重症急性胰腺炎大鼠胃肠运动影响及机制探究【摘要】目的视察Ghrelin对重症急性胰腺炎大鼠胃肠运动的影响，同时探讨其机制。方法Wistar大鼠随机分为比照组、模型组、Ghrelin治疗组,测量肠转运系数；全细胞膜片钳技术记录各组大鼠胃窦环形平滑肌细胞钙敏感性钾电流的数值变更。结果模型组大鼠肠转运系数明显低于比照组05),钙敏感性钾电流高于比照组(PltiO.Ol)；治疗组转运系数高于模型组(Plt;O.05),而电流明显降低(P=0.01).结论重症急性胰腺炎大鼠的胃

2、肠运动减弱，胃肠道平滑肌细胞膜钙敏感性钾电流增加是一个重要的电生理机制，GhrelinnJ以通过降低该电流而促进其胃肠运动。【关犍词】Ghrelin重症急性胰腺炎胃肠运动膜片钳钙敏感性钾电流InfluenceofGhrelinongastrointestinalmotiIityinsevereacutepancreatitisratsandresearchonmechanismAbstractObjectiveToobservetheinfluenceofGhrelinongastrointestinalmotilityinsevereacute2pancreatitis(SAP)rats,a

3、ndstudyonitsmechanism.MethodsWistarratswererandomlydividedintocontrolgroup,SAPmode1groupandGhrelintreatmentgroup.Thechangesoftheirintestinaltransitindexweremeasured;ThewholecellpatchclamptechniquewasusedtorecordthecalciumactivatedpotassiumcurrentoftheirgastricantralcircularsmoothmusclecelIs.ResultsT

4、heintestinaltransitindexofmodelgroupwaslowerthanthatofcontrolgroup(P0.05),anditscalciumactivatedpotassiumcurrentwashigherthancontrolgroup(P0.01);TheindexofGhrelintreatmentgroupwashigherthanthatofcontrolgroup(P0.05)anditscurrentwaslowerthancontrolgroup(P=0.01).ConclusionThegastrointestinalmoti1iIyofs

5、evereacutepancreatitisratwasattenuated，themechanismofwhichmightbethecalciumactivatedpotassiumcurrentofitsgastrointestinalsmoothmusclecellwasincreased.Ghrelincanpromotethegastrointestinalmoti1ityofsevereacutepancreatitisratwithcuttingdownthecurrents.Keywordsghrelin：severeacute3pancreatitis;gastrointe

6、stinalmotiIityjpatchclamp:calciumactivatedpotassiumcurrent重症急性胰腺炎(SeVCreacutepancreatitis,SAP)是一种发病急、并发症多且死亡率高的疾病，有效地限制后期感染和内毒素血症的发生是治疗SAP的关键.通过促进胃肠端动排泄毒素，可以达到调整肠道微生态平衡，削减内毒素汲取的作用，Ghrelin是生长激素促分泌剂（GHSs）受体的内源性配体，在胃肠道表现出和胃动素类似的促进胃肠运动作用，本探讨以胆盐诱导的重症急性胰腺炎大鼠为模型探讨Ghrelin对其胃肠运动的影响，并且通过视察胃窦平滑肌细胞膜钙敏感性钾电流calci

7、umactivatedpotassiumcurrentsIK（Ca）的变更进一步对其作用机制进行探究。1材料与方法1.1动物分组与模型建立WiStar大鼠54只随机分为比照组（假手术组）、急性胰腺炎组（模型组）、Ghrelin治疗组，每组18只，各组乂分3个时间亚组，每组6只，分别于术后6h、12h、24h时间处死。大鼠以10%水合氯醛麻醉后，开腹找寻胆胰管十二指肠乳头开口，运用一次性静脉留置套管针于对系膜缘肠壁穿刺，将套管经乳头部逆行插入胆胰管约ICm,小动脉夹于肝门部阻断胆管后，套管末端接微量泵，以0.1ml/min的速度匀速注入3.5%牛磺胆酸钠（1ml/kg体.重）后关腹。比照组大鼠开

8、腹后仅翻动十二指肠并4触摸腴腺数次后关腹。Ghrelin治疗组于造模前30min、造模后3h赐予Ghrelin（加拿大PhoenixPharlnaCeUtiCalS公司）10nmol/kg腹腔注射,余处理同模型组。1.2 胃肠转运功能测定各组大鼠于处死之前30minEl口腔插入鼠胃管，注入50%Evanblue染料05ml,注完染料30min后，用木棒击头致昏，破心放血后开腹显露全胃，测量幽门至蓝染距离与整个小肠(幽门至回盲部)的长度比，用百分数表示为转运系数，反映胃肠道转运功能状况。1.3 胃窦环形平滑肌细胞IK(Ca)的测定1.3.1试剂与仪器11型胶原酶、胰蛋白酶抑制剂、牛血清白蛋白等均

9、购Fl美国Sigma公司。美国xonInstrument公司Multiclamp700B膜片钳放大器和Digdatal1322A模-数/数-模转换器，日本Nikon公司TSlOO倒置显微镜,美国A1.ASCientifiCInStrUmentS公司DDVC-8IT型8通道灌流系统。1.3.2 主要溶液口台氏液(三ol1.):NaCl147,KCl4,CaCl22,NaH2PO40.42,Na2HP042,MgC121.05,葡萄糖5.5,以NaOH调PH7.4。PSS(mmol/1.)：NaCl134.8,KCl4.5,HEPES10,MgC121,葡萄糖10,CaC122,以TriS调PH7

10、.4。电极内液(mmol/1.)：天冬氨酸110,Mg-ATP5,HEPES5,MgCl21,KCl20,EGTA0.1,di-tris-creatinephosphate2.5.di-sodium-creatinephosphate2.5,以5KOH调pH7.31.3.3 单个胃安环形平滑肌细胞的分别选取比照组和模型组大鼠各10只，模型制备方法同上，造模后12h处死动物显露全UJHo剪取角切迹右侧至幽门的部分(胃窦部)，放入氧饱和的台氏液中，剪开胃炎部，剪除黏膜层后即可暴露出环行肌层，沿环行肌走行方向用剪刀剪取1mm5mm的环行肌条。用含1%H型胶原筋、1%胰蛋白酶抑制剂、2%牛血清白蛋白的

11、消化液于37C水浴振荡消化15min,然后置于4C冰箱中备用，试验前用吸管反复吹打后，取上清液可得单个胃窦环形平滑肌细胞。1.3.4 钙敏感性钾电流IK(Ca)的记录取各组大鼠分别细胞悬液接种于灌流槽中，细胞贴壁后PSS灌流以清除悬浮的细胞碎片。形成吉欧封接后，高电压脉冲击破细胞膜形成全细胞记录模式，进行参数补偿后起先试验参数记录。将细胞膜电位钳制在-60mV,以每10s赐予20InV的阶跃刺激使细胞膜电位从-60mV去极化至100mV,时间持续400ms,分别视察PSS和含10nmol1.Ghrelin的PSS灌流下IK(Ca)的数值变更。1.4 统计学方法采纳膜片钳数据软件ClamPit9

12、.2和统计软件SPSS13.0进行数据分析，在每一细胞上所取得原始电流值进行归一化处理，除以比照组中的最大电流值得出其相对值。试验结果均以(xs)表示，多个样本均数间比较6用单因素方差分析(onewayNOV),均数间两两比较用1.SD检验。2结果2.1一般状况比照组各亚组均无死亡；模型组造模后6h组无死亡，12h组死亡1只，24h组死亡3只：治疗组造模后6h组无死亡，12h组死亡1只，24h组死亡2只。2.2肠道转运系数模型组肠转运系数明显低于比照组(PltiO.05),治疗组转运系数均高于模型组(Plt：o.05),并且各组转运系数均随时间有所增加，见表1。表1肠转运系数的比较注：与模型组

13、比较，#Plt;O.05；与前一时间亚组比较,*Plt;0.052.3钙敏感性钾电流IK(Ca)的变更在PSS灌流下，模型组大鼠与比照组相比，胃窦环形平滑肌细胞IK(Ca)增加，当细胞膜电位去极化至+6OmV时，模型组IK(Ca)的平均幅度为(2.030.20)nA,比照组为(1.630.17)比，电流增加差异具有显著性(PltiO.Ol)；在含10nmoI/1.Ghrelin的PSS灌流下，模型组大鼠与PSS灌流时相比，IK(Ca)明显降低,当细胞膜电位去极化至+60mV时，模型组IK(Ca)的平均幅度为(1.830.13)nA,与PSS灌流下相比,电流降低差异具有显著性(P=SOl),见表

14、2,图Io表2细胞膜电位去极化至+6OnIV时IK(Ca)的变更注：与比照7组比较，ttPlt：0.01；与PSS灌流比较，*Plt;O.053探讨急性胰腺炎早期，胰醉的活化，炎性介质、细胞因子和氧自由基的诱生引发的机体超强的炎症反应是造成早期病理损害的主要缘由，但随后的肠源性细菌移位导致的严峻感染和内毒素血症造成了后期病理生理的恶性循环，对机体产生其次次打击，引发严峻的多脏器衰竭。目前探讨认为，SAP时促进细菌移位的机制主要包括:(I)SAP时胃肠运动功能的变更，如胃肠动力减弱，肠腔积液积气，肠管扩张等，为肠道内细菌的滞留和过度繁殖创建了条件，引起以革兰阴性菌为主的肠道需氧菌过度增殖，而双歧

15、杆菌和乳酸杆菌明显削减，破坏了肠道微生物的平衡24：(2)肠道黏膜屏障的通透性增加。SAP时，肠道作为机体应激的中心器官之一，早期即可出现肠道屏障功能损伤，其机制困难，可能与多方面因素有关56：(3)宿主免疫功能下降。这些因素相互协同作用，促进细菌向肠腔外其他部位移位。本试验中模型组大鼠肠转运系数明显低于比照组(Pit:0.05),证明了SAP下大鼠的胃肠运动减弱，是促进肠源性细菌移位，进而导致严峻感染和内毒素血症的一个重要因素：通过促进胃肠蠕动排泄毒素，可以达到调整肠道微生态平衡，削减内毒素汲取的作用。Ghrelin走生长激素促分泌剂(GHSS)受体的内源性配体，在胃、小肠的神经和肌肉组织中

16、均有其受8体的表达,Ghrdin可以通过胆碱能神经元刺激消化间期胃及小肠的运动7,有试验显示大鼠静脉注射Ghrclin后，胃排空和小肠对流质饮食的传送加快，并可逆转手术后肠梗阻8o此外Ghrelin作为一个胃肠激素,与胃动素(motilin)的分子结构相像，在胃肠道表现出和胃动素类似的促进胃排空作用，可能是由于Ghrelin和胃动素受体之间存在相互作用有关9,本试验中Ghrelin治疗组大鼠肠转运系数显著高于模型组(Plt;O.05),这与以前的试验结果相一样，说明Ghrelin可以通过促进胃肠运动，调整肠道微生态平衡，减轻内毒素汲取，实现对SAP的治疗作用。大多数胃肠道运动的抑制性反应都与胃肠道平滑肌细胞膜的超极化有关，胃肠道平滑肌超级化的离子机制尚不清晰，许多试验表明这种超极化可能是由于各种缘由使钙敏