MRPS5 对膀胱癌细胞增殖能力及干性特征的影响.docx

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1、率较高，占泌尿系肿瘤近90%以上1,20其发病机制不详，可能涉及到癌基因激活和抑癌基因失活3。临床根治性膝胱切除术仍是膝胱癌治疗的主要治疗方式，但术后病人生活质量极度下降，且术后复发率高，5年生存率仅50%左右4,5,因此，发觉利于临床诊断、治疗、预后评估的分子标记显得尤为重要。机体苍老是肿瘤发生的易感因素，探讨证明长寿相关基因参加调控这种易感性，如线虫长寿相关基因Sir2、daf-2.Iin2、dct2,nnt-1等既能调控寿命，也能促进肿瘤细胞的增殖或凋亡，而它们在哺乳动物都有相应的同源基因6-9。同时肿瘤细胞线粒体DNA突变率高，诸如线粒体Cytb、ND6等基因突变甚至能促进肿瘤细胞演进

2、，因此线粒体DNA突变所致的线粒体功能障碍已成为肿瘤细胞重要特点之一10T2.最新探讨发觉线粒体核糖体蛋白S5(miIochondrialribosomalproteinS5,MRPS5)基因通过线粒体代谢机能障碍途径调控线虫及小鼠的寿命，而且MRPS5作为线粒体核糖体28S小亚基成员，与线粒体能量代谢相关，我们由此推想肿瘤中MRPS5也可能发生功能变更进而调控肿痛生物学功能。关于其在膀胱癌中的作用尚无报道，本试验将探讨其对膀胱癌细胞增殖及干性特征的影响。1 .材料与方法1.1试验材料人膀胱癌及癌旁组织由第三军医高校西南医院泌尿外科张恒收集。NOD/SCID小鼠购于重庆腌鑫生物技术公司并饲养于

3、第三军医高校西南医院试验动物中心。人膀胱癌T24细胞由我室保存。RPMI1640培育基，胎牛血清，胰醉等细胞培育相关试剂购自Gibco公司。兔抗人MRPS5,Nanog.OCt4抗体购自abeam公司，兔抗人GPDH,Sox2抗体购自CellSignaling公司，小鼠抗人C-MyC抗体购自SantaCruz公司。CellTiter-BlueCellViabilityAssay试剂盒购自PrOlnega公司。细胞周期检测试剂盒购Fl碧云天公司。分子克隆试剂及慢病毒包装质粒等主要由本室保存。BBG16UV1511.二氧化碳培育箱及CKX41-32PH倒置相差显微镜等分别购自Thermo.Olym

4、PUS公司，流式细胞仪、VarioskanFlash多功能酶标仪由第三军医高校西南医院公共试验平台供应。1.2主要方法1.2.1细胞培育T24细胞培育于10%胎牛血清RPMII640（含青、链霉素）培育基中，在温度为37C,5%CO2浓度的培育箱中孵育，细胞密度达80%-90%进行传代。试验采纳对数期长势良好的细胞。成球培育基为DMEM/F12,含20ngmlEGF、20ngmlbFGF.20mgmlB27、汽甲基纤维素。培育条件同前。1.2.2 慢病毒干扰载体感染T24细胞按分子克隆技术制备靶向干扰MRPS5的载体P1.KO.l-shMRPS5及比照载体P1.KO.1-shScramble,

5、进行慢病毒包装后收集病毒液分装储存于-80,Co细胞分为P1.KO.l-shMRPS5试验组及P1.KO.1-shScramble比照组。感染前细胞接种于六孔板内，待融合度达40$时分别加病毒液感染16小时，再换液后接着培育。1.2.3 WesternBlot病毒感染72小时后裂解细胞提取总蛋白，煮沸变性后行SDS-PAGE电泳，湿转到NC膜，5%脱脂牛奶室温封闭2小时后，一抗4度过夜，PBST洗涤，二抗室温孵育1小时，PBST洗涤后显影拍照。MRPS5表达用于检测病毒干扰效率。NanOg、OCt4、C-Vyc、Sox2抗体用于反映肿瘤干性转录因子13,14的表达。人膝胱癌及痛旁组织经裂解后检

6、测MRPS5的差异表达。GAPDH作为内参。结果重熨3次。1.2.4 细胞增殖实力检测分别收集感染近60小时的T24细胞，流式细胞仪计数（解除7-AAD阳性死细胞）后铺96孔板。每孔100Ul培育基，各含100O个活细胞。铺板后其次天起检测细胞活力（计为第1天）。根据CellTiter-BlueCellViabilityAssay试剂说明操作。试验重复3次。1.2.5 细胞周期检测分别收集病毒感染72小时的细胞，PBS洗，70%乙醉4度固定过夜，根据周期检测试剂说明行PI染色后流式488nm波长检测。试验重曳3次。1.2.6 成球试脸感染72小时的T24细胞，经流式细胞仪计数（解除7-D阳性的

7、死细胞）后铺超低黏附96孔板。每孔100Ul成球培育基，含10个活细胞，各铺10个复孔。静置培育14天后倒置显微镜下视察成球率（每孔细胞球数目总和/每孔加入的细胞数100%）及直径，并拍照。1.2.7 小鼠体内成瘤试验10只5周龄雄性M）D/SCID小鼠，体重约16gT8g,随机均分为P1.KO.l-shMRPS5试验组及P1.KO.1-shScramble比照组。将分别经病毒感染72小时后的T24细胞传代扩大培育后，分别用无菌PBS制成单细胞悬液并计数。试验组每只小鼠双侧背部皮下各注射5106试验组细胞，比照组则注射相同数目比照组细胞。待小鼠皮下成瘤后每2天记录移植瘤体积（肿瘤体积=短径长径

8、0.52）,第6周末处死小鼠并取出移植瘤，拍照并称市。1.2.8 统计学处理计量资料以XS表示，采纳SPSSI3.0行两独立样本I检验。2结果2.1临床组织标本检测MRPS5差异表达临床收集的12对膀胱癌及癌旁正常组织裂解提蛋白，行WeSternb1。1,结果显示（图1）,8对癌组织中（66.7%）MRPS5表达高于癌旁组织。a:膀胱癌癌旁正常组织；b：膀胱癌组织图1westernblot检测12对膀胱癌及癌旁组织MRPS5表达2.2慢病毒感染T24细胞慢病毒P1.KO.l-shMRPS5（试验组）感染T24细胞72小时后,westernblot检测MRPS5蛋白变更，结果显示同P1.Ko.I

9、-ShScramble（比照组）相比，MRPS5表达降低（图2）o表明构建的干扰载体有效。图2westernblot检测MRPS5的干扰效率2.3干扰MRPS5使T24细胞增殖实力下降慢病毒P1.KO.1-shMRPS5（试验组）及P1.KO.I-ShScramb1.e（比照组）分别感染T24细胞60小时后，流式铺板，其次天起按试剂说明连续5天检测细胞生长曲线，与比照组相比，干扰MRPS5后细胞增殖实力下降，差异具有统计学意义（PO.05,P0.01,图3）Oa:PO.01,b:P0.05,两组相比图3干扰VRPS5对T24细胞生长的影响2.4干扰MRPS5变更T24细胞周期慢病毒P1.KO.

10、l-shMRPS5及P1.KO.1-shScramble分别感染T24细胞,72小时后收集细胞进行PI单染流式检测，结果显示干扰MRPS5后S期细胞明显增多（图4）,提示干扰MRPS5后细胞可阻滞于S期。OAOBA：P1.KO.1-shScramble比照组：B：P1.KO.l-shMRPS5试验组图4干扰MRpS5对T24细胞周期的影响2.5干扰MRPS5抑制T24细胞中的干细胞生物学特征P1.KO.1-ShMRPS5(试验组)及P1.Ko.1-ShSCranlble(比照组)病毒分别感染T24细胞，行成球试验及westernblot数据显示试验组平均成球率(0.0500.053)与比照组平

11、均成球率(0.0600.052)相比无差异(P0.05),但同高倍镜下试验组成球直径明显减小(图5):同时，与肿瘤干细胞干性特征相关的部分转录因子NanOg,0ct4.c-Myc,Sox2表达也下调。由此可见，干扰MRPS5可以减弱T24中的干细胞的干性特征。OOBA：成球试验(倒置显微镜200)；B：westernblot检测干性转录因子表达图5干扰MRPS5对T24细胞干性特征的影响2.6干扰VRPS5抑制小鼠体内成痛实力P1.KO.1-shScramble(比照组)及P1.Ko.1-ShVRPS5(试验组)小鼠均成痛10个。比照组揄体平均体积(0.7840.278)cm3大于干扰组(0.

12、5000.245)cm3(P0.05,图6),且比照组瘤体平均重量(0.8620.372)g较干扰组(0.4120.248)g重(P0.05,图6)图6干扰MRPS5对小鼠成瘤实力的影响3探讨膈胱癌是最常见的泌尿系恶性肿痛，其发生发展机制非常困难，主要涉及c-Myc.h-ras.EGFR等癌基因的激活，以及P21、P53、Rb.pl6ink4apl9ink4b等抑癌基因的失活3,15.但最近探讨发觉除了经典的癌基因及抑癌基因，一些参加线粒体能量代谢的关键蛋白，如细胞色素B(Cytb)、丙酮酸脱氢酶激的1(PDKl)、异柠檬酸脱氢酶12(IDH12)、延胡索酸水化酶(FH)、琥珀酸脱氢酶(SDH

13、)等基因的突变也能参加正常细胞的恶性转化并促进肿瘤的发生发展10,16-18。VRpS5作为线粒体核糖体蛋白28S小亚基成员，其主要作用是参加合成线粒体有氧呼吸链的部分蛋臼，与机体能量代谢有关，因此几乎广泛分布于各组织器官。近期探讨表明，MRPS5能调控线虫及小鼠的寿命，而机体的苍老与肿瘤发生易感性具有相关性8。并且已鉴定的多种寿命相关基因同时扮演着癌基因或抑癌基因的角色，这提示我们MRPS5可能参加肿瘤的发生发展。本课题合作组成员前期发觉在人肝痢组织中MRPS5表达明显高于正常组织(未发表)，且本探讨通过对12对人膀胱癌及癌旁组织MRPS5表达的检测也发觉存在这种差异，提示MRPS5在膀胱癌

14、发生发展中起着重要作用。而针对MRPS5对某一肿瘤细胞生物学功能的探讨较少，其是否影响膀胱癌细胞增殖、干性实力等也不清。本探讨结果显示，慢病毒干扰载体P1.KO.1-ShMRPS5能显著降低MRPS5表达，且干扰MRPS5后膀胱癌T24细胞的增殖实力下降，其一方面机制可能是通过抑制细胞周期转换，使周期阻滞于S期。同时，干扰MRPS5不变更T24细胞平均成球率但减小成球体积，同时降低肿病干细胞相关转录因子Nanog,0ct4,c-Myc,Sox2的表达，而肿瘤干细胞理论认为肿瘤中存在一小群具自我更新和分化潜能的细胞，它们参加肿瘤的起始，生长，侵袭转移，复发等14,190因此提示MRPS5可影响膀

15、胱癌细胞中的干细胞的干性实力，但缺憾的是尚没有牢靠的分子标记以探讨MRPS5对T24中干细胞干性表型的影响。进一步通过NOD/SCID小鼠皮下成瘤试验证明干扰MRPS5能抑制小鼠的成瘤实力，使成瘤体积削减重量收轻。综上可知VRPS5能促进膈胱癌细胞增殖实力及干性特征，可能在膀胱跪中扮演类似癌基因的角色。除此之外，我们也证明MRPS5并不影响T24细胞的迁移实力。从MRPS5作为线粒体代谢调控因子角度看，肿痛作为代谢性疾病，其发生发展与线粒体代谢性功能紊乱有关，而MRPS5功能突变只是部分事务，或许正是在肿痛微环境的适应过程中MRPS5发生了这些功能性变更。有关MRPS5对膀胱癌细胞能量代谢如ATP、乳酸、活性氧的影响亟待深化探讨，这将帮助我们了解MRPS5代谢性调控膀胱癌细胞功能的相关机制。综上所述，本探讨初步证明了MRPS5在膝胱癌细胞中的部分生物学作用，有关其更多功能及分子机制需后续进一步探讨。这或许能为膝胱癌的诊断、治疗及预后供应牢靠的分子标记。参考文献：1FengC,GuanM1DingQ,etal.Expressionofpigmentepitheliurn-derivedfactorinbladdertumouriscorrelatedwithinterleukin-8yetnotwithinterIeukin-!alphaJ.JHuazhon