Protein A亲和层析柱亲和层析纯化人IgG1类嵌合抗体.docx

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1、技术方法名称：ProteinAsepharose4fastflow亲和层析柱纯化人IgGl类嵌合抗体基本原理:葡萄球菌A蛋白(staphylococcalproteinA)在PH值中性或碱性条件下与多种哺乳类动物IgG分子的FC段特异结合，而在酸性条件下可以解密，可用于纯化人和小鼠IgG及其亚类(IgG3除外)。sepharose4fastflow是高度交联的4$的agarose衍生物，具有很好的动力学，在固相亲合吸附中有很好的乂析质量，其刚性使其可志向地用于生产规模。PrOCeinAsepharose4fastflow是proteinA与固相基质sepharose4fastflow的结合,是

2、高特异、高稳定性凝胶,当凝胶装填柱床后，能够特异性捕获Fl的抗体。用途及受限因素,ProteinAsepharose4fastflow的IgG高载量和允许样品通过的高流速，使其成为试验室和生产规模制备抗体的志向凝胶.2.ProteinAsepharose4fastflow在纯化过程中会有少量集团脱落，如需去除用离子交换QSepharoseHP或凝胶过滤SUPerdeX200。3、在不同IgG亚类之内，甚至在相同亚类之内，都存在着自然的多样性，因此对于每个待纯化的单抗都必需首先优化选择结合和洗脱系统。4、层析几批样品之后，尤其流速明显减慢之后，需重装柱子。试验材料，1 .ImlProteinAS

3、epharose4FastFIOW亲和层析柱生产厂商:pharmacia公司2 .有抗体分泌的细胞上消(本试验室构建的嵌合抗体为人IgGl类嵌合抗体，宿主细胞CH0)3 .柱体平衡液：0.1MPB缓冲液(PH7.0)4 .抗体洗脱液：0.1mol1.柠愫酸一柠除酸钠缓冲液(PH3O)5 .ImOv1.TriS碱溶液(不调PH)6 .透析液：0.01MPBS(PH7.4)7 .20%乙醇8 .0.45m波器9 .真空泵(本操作潦程操作程序以Iml凝胶为例试验设计，1 .样品处理: 取肯定体枳的有抗体分泌的细胞培育上清。(依据ImlProteinASepharose4FastFlOW亲和层析柱能有

4、效结合约Mmg的抗体，结合待纯化上清中抗体含量，计穿出最大纯化上清的体积) 将细胞上消4C离心100oOrPmX20min,去除细胞碎片。 细胞上清经045Um灌膜抽灌脱气，除去未沉降的蛋白等一些杂质，留样Iml.记录样品体积。 用IOmM的NaOH调整上清的PH值至7.0左右。2 .平衡柱子：以0.IM的PB(PH7.0)缓冲液平衡ImlProteinASepharosc4FastFlow亲和层析柱,流速lmlmin,体积20ml,充分去除乙醇和杂质,平衡至OD28(XO.()I。3 .上样：将上述处理过的样品液以lmlmin流速上样，样品温度应保持与柱床温度一样，否则简单产生气泡,影响柱效

5、,收集流穿液，混匀后取样Iml,登记流穿液体积.4.洗涤：以0.1M的PB(PH7.0)缓冲液洗涤上样后的ImlProteinSepharose4FastFlow亲和U析柱，流速2mlmin,体积50ml,洗涤至OD2800.02保留液体待测.5 .洗脱：以0.1M的柠椽酸(PH3.0以冲液洗脱上样后的ImIPrOleinASepharose4FastFl。W亲和层析柱,流速lmlmin,体积不限，分管收集,同时用IMTriS调其PH至7.0左右,洗脱至0D2800.01,保留液体待测。6 .纯化后抗体处理：用分光光度计测OD280,初步计鸵产量。将该样品置于透析袋中，在PBS(PH7.4)中

6、透析，换液2-3次,6-8h次。将样品用无菌的0.2IlM的漉器过灌纯化的抗体,然后分装于ISml无菌塑料管中，-2Ot储存备用。7 .再生：再以OJM的柠愫酸(PH3.0)缓冲液再生洗脱后的ProIeinASepharose4FastFIOW亲和层析柱，流速lmlmin,体积3-5ml8 .保存：以含20%乙静的PBS(PH7.4)平衡再生后的洗脱后的ProteinSepharose4FastFIOW亲和层析柱，流速加lmin,体积30-5Om1.关闭柱子,整体浸泡在含20%乙醉的PBS(PH7.4)中，4C保存。留意事项:1 .本试验全过程应尽量在4C下操作。2 .细胞上清必需高速离心并过

7、滤，防止污染柱料3 .防止柱子流干、冻冰.4,上样液置于4C卜上样，上样一段时间后流速将卜.降，应尽量解除柱内气体。5 .洗脱时，换洗脱级冲液应留意解除凝胶表面前步残留液体体积，防止影响洗脱效果。6 .流穿液和每步洗柱液应保留，待试验完毕后统一处理。结果观查及分析的原则采纳分光光度计测OD280,按lmg=1.35OD28()计算抗体;0。同时结合夹心E1.lSA检测上样前与上样后嵌合抗体含贵的改变，以计钵上样结合fit,得出纯化效率“试题胜利或知的关键因索PH值在中性或碱性条件下，ProtcinA和人源抗体FC段能够特异性结合，而在酸性条件卜.可以解离，因此洗涤液和洗脱液的PH值是纯化成败关键。