SARSCoV N蛋白和MAP19的相互作用_0.docx
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1、SARSCoVN蛋白和MAP19的相互作用SARSCoVN蛋白和MAP19的相互作用【摘要】目的:探讨SARSCoVN蛋白与MAP19之间的相互作用。方法:利用免疫共沉淀试验验证SARSCoVN蛋白与MAPl9的相互作用,并利用Westernblot检测SARSCoVN蛋白对MAPI9表达量的影响。结果:SAKSC。VN蛋白与MAPI9能够在细胞内相互作用,且SRSCoVN能够显著提高MAP19的表达量。结论:SAKSCoVN蛋白与MAPl9能够在细胞内形成复合物,将为进一步探讨SARSCoVN蛋白与MAP19相互作用的生物学功能供应试验基础。【关键词】SARSCoVN:MP19;相互作用Ab
2、stractAIM:Severeacuterespiratorysyndromecoronavirus(SRSCoV)istheetiologicalagentofSRS,anemergingdiseasecharacterizedbyatypicalpneumonia.UsingayeasttwohybridscreenwiththenucIeocapsid(N)proteinofSARSCoVasabait,theNproteinwasfoundtointeractwithMAB19,anonenzymaticproteinofMASP(mannanassociatedserineprot
3、ease).TheinteractionbetweenSARSCoVNandMAP19wouldbefurthertestedincelIsinthisarticle.METHODS:TheinteractionbetweenSARSCoVNandMAP19wasdemonstratedbyi11munocoprecipitation,andtheamountofMAP19influencedbySARSCoVNwasinvestgatedbyWesternblot.RESU1.TS:TheinteractionbetweenSRSCoVNandMAP19wasalreadydemonstra
4、tedbyimmunocoprccipitation.SRSCoVNgreatlyincreasedtheamountofMAP19.CONC1.USION:SARSCoVNcanbindwithMAP19incells.OurstudymaybeconductivetofurtherresearchintothemolecularmechanismofactionbetweenSARSCoVNandMAP19.KeywordslSARSCoVN:MP19;interactionSRS冠状病毒(SARSCoV)是SARS感染的元凶,以全长SARSCoVN蛋白为诱饵蛋白筛选人胎肝细胞cDN文库时
5、,发觉SARSCoVN蛋白可能与MAP19相互作用。SRSCoVN蛋白是SARS冠状病毒蛋白(SARSCoV)的结构蛋白,与病毒RNA结合形成核衣壳,是主要的抗原分子1,2MAP19是MASPs家族的成员,是MASP2的单一基因的选择性剪切产物3。MASPs可通过MBI.结合细菌或病毒表面的甘露糖残基结合而激活,MSP2可水解补体C4和C2,形成C3转化筋,是凝集素活化途径激活补体的重要的胸4。凝集素活化途径是补体系统活化的第三条途径,也是机体早期反抗病原微生物感染的一种防卫机制。MB1.途径缺乏在成人和儿童中可诱发各种感染性疾病。所以,一些病原微生物利用MB1.来入侵细胞5,6。本探讨利用免
6、疫共沉淀(IP)试验验证SRSCoVN蛋白与MAP19的相互作用,结果发觉SARSCoVN蛋白与MAP19能够在细胞内相互作用,且SARSCoVN能够显著提高MAP19的表达量,该结果为SARSCoVN在SARS致病机制的进一步探讨奠定了基础。1材料和方法1.1细胞培育293细胞均用含100m1./1.胎牛血清和100U/m1.青霉素、100U/m1.链霉素的DMEMdnvitrogen公司产品)在C02含量为50m1./1.的37C孵箱中培育,采纳消化法进行细胞传代。1.2质粒构建N基因(GcnBankaccessionnumberY274119)从患者血清的SRSCoVRN通过RTPCR获
7、得,(带EcoRI的上游引物,5Cggaattccatgtctgataatggaccc3:带BamHI的下游引物5GCGGTCCTTTGCCTGGTTGATC3)。扩增产物用PCR纯化试剂盒(ProInega)进行纯化,随后用EcoRI和BamllI的切,然后与经过同样根切的PEGFPCl载体(Clontech)连接,转化,测序。随后,N基因被克隆到pcDNA3Flag载体(Invitrogen),构建了pcDNA3FlagN表达质粒。MAP19基因片段缺失了5端22-56bp的DNA序列,我们实行的策略是利用PCR反应补全缺失的片段。补全MAP19基因片段所用引物:Pfl(49bp89bp)
8、(带BamIII的上游引物)5Cgggatccatgaggctgctgaccctcctgggccttc3;Pf2(35bp99bp)5CcctcctgggccttctgtgtggctcggtggccacccccttgggcccgaagtggccgGaacctgtg3;ph带ECoR的下游引物):5cggttcctgggctctgctctg3。1. 3细胞培养与转染细胞转染采用VigOraS1.ipofectdnvitrogen,Inc.)转染试剂,严格根据转染试剂说明书进行操作。以100mm的培育皿为例,当培育皿中的细胞生长至覆盖60%80W11l底面积时进行转染。转染前1h将旧的培育基吸出,
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