钩端螺旋体病原学检查、核酸检测.docx

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1、附录A钩端螺旋体病原学检查A1临床样本显微镜检查A.1.1患者血液直接镜检A1.1.1取早期患者血液一滴，加蒸慵水一滴，使血细胞溶解,在班视野显微模卜检有无活动的钩端螺板体。A.1.1.2取期患者静脓血1ml.-2ml.于无菌试管中静置凝固，窗心沉淀,吸取血清与血细胞交界处略显臼色的悬液，汽袋玻片上，在暗视野显澈镜下检杳有无活动的钩端蛔旋体，A.1.1.3采集早期患者静脉1ml.加于含2m1.枸彼酸钠盐水管中100Or.in离心10min.吸上层血浆置另一清洁管中.3000rmi11-3500rin禹心3011in-60min.弃上游,取沉淀物一滴于玻片上，用暗视野显微镜检查有无活动的钩湘螺旋

2、体.A1.2患者尿液五接镜检无菌采集患者尿液，取一滴尿液置于段成片上，加盅成片，在暗视野显微镜下检查有无活动的钝端螺旋体.A2细前分离培养A.2.1患者血液培养业培养应在发病以初IOd内并在使用抗生素治疗前进行。无的操作取患者血液1001.-200M1.,接种到5ml.-10atKorthofOUH(Ellinghuason-Mccullough-Johnson-Harris)等适宜培养基中，平行接种2管3管,在28C培养.每隔5d-7d收培养物在暗视野显微悔下观察有无一端或两端弯曲成的状、菌体呈现问号状、C或S形态的理旋体生长,若有生长，可进一步开展鉴定.若未见生长，应继续培养6。d,仍不见

3、生长方作阴性处理。A2.2患者尿液培养采集发病1W后的患者中段尿30ml.50B1.于无菌离心管中，以100oOlin离心1min.取沉渣0.5m1.接种于笫一管5UKorthof或尔”培养菸中，混匀后吸05ml,接种于第：若5mUft养基中，混匀后吸0.5ml.接种于第三管5ml.培养基中.平行接种2管3管,在28C培养，短隔5d7d取培养物在咯视野显微钺卜观察有无一端或两蛤弯曲成钩状、薄体我现问号状、C或S形鱼的螺旋体生长，若有牛.长，可进一步开展鉴定,若未见生长,陶继续培养60d,仍不见生长方作阴性处理.为提高检出率和减少污染.可在采集尿标本的前一天晚上给忠若TI眼碳酸氯网(NaiICO

4、,)2g4g.I可时在培葬基中加入100Pg三l.一400PgAn1.5械眼喳Ig或1/2000的碘胺啼膑,尿液标本应在曲乐2h内完成接种，A2.3患者脑背液培养脏脊液培笄应在发病最初10d内进行.对有脑版刺激和其.他神经系统症状的忠者，股椎穿刺排取脑许液，取0.5mUW音液接种于51.KOrlhof或EM川培养及中，平行接种2管-3管，在28U培养，每隔5d-7d取培养物在暗视野显微镜下观察有无一端或两端弯曲成钩状、M体呈现向号状、C或S形态的螺旋体牛长,若有生长，可进一步开展签定。若未见生长，应缚续培养60d,仍不见牛.长方作阴性处理。A.2.4动物接种培养取患者血液或脑汗液0.5m1.l

5、ml或尿液2m1.接种金黄地以(体由20-50或幼龄豚以(体击120g-200卜砥两侧皮卜或者腹腔，进行发病观察，一周后取心曲暗视野如做镜卜观粢以及进行钩端螺旋体分离.A3钩理螺旋体菌株鉴定A.3.1显微镜凝集试验(Microscopicagglutinationtest；MAT)A.3.1.1操作步骤待检菌株需提前在暗视野显微镜下检查，要求每400倍视野下不少于100条200条，运动活泼并无自凝.将我国15群】5型标准曲操免疫家处获得的诊断血清，56C水浴灭活30min后，用生理盐水以1：50开始稀作，稀择到1：6400,不同稀杼厦备血清杵诊断血清、阳性对照（相应标准的株）及空白对照生理盐水

6、各取50U1.加入备反应孔中,分别取待检分离株培养液50U1.加入上述稀择度血清及对照中.摇匀后37C孵育1h.取反应液及对照,放置载物玻片上暗视野显微镜下观察凝集情况,凝集滴度按原血清稀锋倍数X2计算.A. 3.1.2终点;S集满度的判定以出现+凝集（即视野中50%钩端蝶旋体被凝生）的群血清最高检择度作为终点凝维滴度,确定所网血清称.A3.2核酸检测可疑曲株进行核酸检测,检出饱用螺旋体特弁性核酸可判定为仙端螺旋体曲，见C.1和C2.附录B（规范性）钩端螺旋体病血清学检查B. 1标本要求需聚集患者急性期和恢发期双份血清进行检测,急性期血清应在首次检视患者时采取，血清分离后进行第次抗体检测，根据

7、患者的病程（一银为3w-1获得恢现期血清后，进行第：次抗体检测,两次间隔2w3w.来用显微镜凝集试验和酹联免疫吸附试脸进行检测。C. 2显微镜凝集试验（MAT）8. 2.1抗原的选择和制备格我国15群15型钩端爆旋体标准菌株接种于KOrtho或EYJH等适宜培养基中，28C培养5d-7d.暗视野显微镜检查，每400倍视野下不少于100条200条,运动活泼并无自凝者可作为抗原.B. 2.2操作步场！患者血清56C水浴灭活30Inin后，用生理拉水以I：50（早期患者血清）或1：100（恢笑期患者Im清）和I：400两个稀择度做定性试验,稀糅血清以及阳性对照、阴性对照及空白对照生理热水各取501.

8、加入各反应孔中。分别取15个代表株钩始螺旋体的培养液50H1.加入上述稀样度血清及对照中.推匀后37C孵百1h.取反应液及对照，放置载物成片上暗视野显微诜卜Q空凝集情况，若稀释血清与某一血清群佝端螺旋体抗原发生凝集,需进一步稀择该血清再与该群物端端旋体抗原进行显微镜凝集试验.以测定此凝集滴度，凝集滴度按原血清稀择倍数X2计算：.8.2.3终点凝集满度的判定以出现+凝集（即视野中50%的端螺旋体被凝集）的血清最高稀择度作为终点凝集滴度.83酹联免度吸附试脸（E1.ISA）可使用商品化试剂盒，按照操作说明书进行操作。附录C规色性)钩端端旋体核酸检测C.1聚合萌链式反应(PCR)桧测钩端螺旋体特异基

9、因C.1.1目标基因从临床标本和分离培养的苗株中检测钩端螺旋体核酸时，通常以SeC1利/7周乍为目标拓因,7a建因用来检测(AirSM“er/致病性钩端螺旋体，sm)基因怆测其他常见的致病性的端螺旋体,也可选择其他特异性基因.C.1.2参考引物序列参考引物序列见表C1.表CIPCR用参考引物序列目标系因引为名称序列(5-3)扩增片段长度(bpSeCYGlCTCAATCGCTCTATAAAAGT285G2GGAAAACAATGGKGGAAGHaBB6I-IACAACFGGAAACIVTAC563t-T(XHAAGTCGAACCIATGAC.1.3模板制备临床标本和已经分离培养的菌株使用商品化基因

10、组IWA提取试剂盒，具体操作方法按试剂盒说明进行.C.1.4Pcfi反应体系一次总限25H1.的反应体系如表C.2所示.表C2PCR反应体系中的成分及加样量试剂体枳酹和3冲液12.51.上游引物（10HnOM1.）1!.下游引物(10MlIJ1U1.将冽模板（阳性对照）31.-5M1.(1u1.2m1.炖水补足至25U1.反应设立鲂控参数：使用纯水作为阴性对照，用已知钩端爆旋体菌模板作为阳性对照.加样序：首先加入阴性对照，然后加特测模板，出后加入阳性对照。C.1.5PCR扩增95匕预变性5ai11.1个循环：94C变性60s,55C退火60s,72C延伸90s,35个循环；展后72C延伸10m

11、ineC.1.6PX扩增产物的检测分析PCR产物各取5P1.加入脂糖凝胶的加样孔内（不含染料的ix需要加入1M.上样缓冲液），加入Marker51.5V/c=电泳40min观察条带。PCR产物也可以进行测序分析.C.1.7结果判读在紫外透射仪或凝胶成像系统中观察结果，当阴性对照和阳性对照成立时，如钩端螺旋体祀基因犷地出现颈期条带,则表明检测标本阳性。当阴性对照和阳性对照不成立时，需要重新进行检测.测序结果与的端螺旋体菌特异基因序列匹配.表明标本阳性.C.2实时荧光定量索合的链式反应（Real-TimePCR）检测管端螺旋体特异姑因C.2.1目标基因从临床标本和分肉培养的菌株检测的端螺旋体时，以

12、佝端螺旋体阻Sr心：，1基因和ipi.32聪因作为目标基因，也可选择其他特异性范因。C.2.2试剂选择可使用商品化试剂盒，按照操作说明书进行操作，也可按照以下步骤进行.C.2.3参考引物和探针序列IeS，椒供因和山山修眩因参考引物和探针序列见表C.3.表C.3Real-TimePCR引物和探针只体信息目标将因名称序刊16SrRM1.eptoF5,-(XCGCGTCCCATTAG-3,l.cptnR5-ICCATTGGOXGR*CAC-31.eptoP5-(FAM)CrCKrMGGcGKGjVTCGGTIMK3(BIIQl)QP1.32IiP1.32-45F5-AGCATTACCGCTrcTGC

13、TG-3lip1.32-286R5,-GAACtCCCA11CGCGXT-31iplJ2-Prob5,-VIC-AAGCCAGGACAAGCGCCG-3他IQI)C.2.4模版制备同C.1.3,C.2.5RCaI-TimePCR反应体系一次总址20U1.的RCalTiaePCR反应体系见表C.4.表C.4ReaI-TimePCR反应体系中的成分及加样量试剂体枳i和缓冲液2)10M1.上带引物(10wl1.0.4H1.下游引物10M11.0.4H1.探计溶液10wl1.0.4.待测模板t阳性对照)3l.-5l.(1-5l.)地水补足至20M1.反应设立质捽参数：使用纯水作为阴性对照,用已知钩端螺

14、旋体菌模板作为阳性对照.加样顺序：首先加入阴性对照，然后加价测模板，最后加入阳性对照.C.2.6ReaI-TimePCR扩增一般使用两步法进行扩增,蛰考程序如下：95C预变性10s,1个循环：扩增反应:95C5s,60-C10s,40个循环.不同的荧光定居PCK仪扩增的程序会有一些差异，可根据所使用的仪器对反应程序进行适当调整。C. 2.7结果判定当阴性对照和阳性对照成立时，依Sr4基因和一加处两个比基因均Ct值小于35时判断为阳性，单掂因或者双基因35WCl侑37时结果可疑，需重新采集样本无新检测，I6S”期基因和%Z关阚个纪喀因均Cl值大于或等于37或没有峥值时判断为阴性。当阴性对照和阳性对照不成立时,需要重新进行检测.若采用商品化试剂盒,结果判断依据参照试剂盒说明书操作。