钩端螺旋体病原学检查、核酸检测.docx
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1、附录A钩端螺旋体病原学检查A1临床样本显微镜检查A.1.1患者血液直接镜检A1.1.1取早期患者血液一滴,加蒸慵水一滴,使血细胞溶解,在班视野显微模卜检有无活动的钩端螺板体。A.1.1.2取期患者静脓血1ml.-2ml.于无菌试管中静置凝固,窗心沉淀,吸取血清与血细胞交界处略显臼色的悬液,汽袋玻片上,在暗视野显澈镜下检杳有无活动的钩端蛔旋体,A.1.1.3采集早期患者静脉1ml.加于含2m1.枸彼酸钠盐水管中100Or.in离心10min.吸上层血浆置另一清洁管中.3000rmi11-3500rin禹心3011in-60min.弃上游,取沉淀物一滴于玻片上,用暗视野显微镜检查有无活动的钩湘螺旋
2、体.A1.2患者尿液五接镜检无菌采集患者尿液,取一滴尿液置于段成片上,加盅成片,在暗视野显微镜下检查有无活动的钝端螺旋体.A2细前分离培养A.2.1患者血液培养业培养应在发病以初IOd内并在使用抗生素治疗前进行。无的操作取患者血液1001.-200M1.,接种到5ml.-10atKorthofOUH(Ellinghuason-Mccullough-Johnson-Harris)等适宜培养基中,平行接种2管3管,在28C培养.每隔5d-7d收培养物在暗视野显微悔下观察有无一端或两端弯曲成的状、菌体呈现问号状、C或S形态的理旋体生长,若有生长,可进一步开展鉴定.若未见生长,应继续培养6。d,仍不见
3、生长方作阴性处理。A2.2患者尿液培养采集发病1W后的患者中段尿30ml.50B1.于无菌离心管中,以100oOlin离心1min.取沉渣0.5m1.接种于笫一管5UKorthof或尔”培养菸中,混匀后吸05ml,接种于第:若5mUft养基中,混匀后吸0.5ml.接种于第三管5ml.培养基中.平行接种2管3管,在28C培养,短隔5d7d取培养物在咯视野显微钺卜观察有无一端或两蛤弯曲成钩状、薄体我现问号状、C或S形鱼的螺旋体生长,若有牛.长,可进一步开展鉴定,若未见生长,陶继续培养60d,仍不见生长方作阴性处理.为提高检出率和减少污染.可在采集尿标本的前一天晚上给忠若TI眼碳酸氯网(NaiICO
4、,)2g4g.I可时在培葬基中加入100Pg三l.一400PgAn1.5械眼喳Ig或1/2000的碘胺啼膑,尿液标本应在曲乐2h内完成接种,A2.3患者脑背液培养脏脊液培笄应在发病最初10d内进行.对有脑版刺激和其.他神经系统症状的忠者,股椎穿刺排取脑许液,取0.5mUW音液接种于51.KOrlhof或EM川培养及中,平行接种2管-3管,在28U培养,每隔5d-7d取培养物在暗视野显微镜下观察有无一端或两端弯曲成钩状、M体呈现向号状、C或S形态的螺旋体牛长,若有生长,可进一步开展签定。若未见生长,应缚续培养60d,仍不见牛.长方作阴性处理。A.2.4动物接种培养取患者血液或脑汗液0.5m1.l
5、ml或尿液2m1.接种金黄地以(体由20-50或幼龄豚以(体击120g-200卜砥两侧皮卜或者腹腔,进行发病观察,一周后取心曲暗视野如做镜卜观粢以及进行钩端螺旋体分离.A3钩理螺旋体菌株鉴定A.3.1显微镜凝集试验(Microscopicagglutinationtest;MAT)A.3.1.1操作步骤待检菌株需提前在暗视野显微镜下检查,要求每400倍视野下不少于100条200条,运动活泼并无自凝.将我国15群】5型标准曲操免疫家处获得的诊断血清,56C水浴灭活30min后,用生理盐水以1:50开始稀作,稀择到1:6400,不同稀杼厦备血清杵诊断血清、阳性对照(相应标准的株)及空白对照生理盐水
6、各取50U1.加入备反应孔中,分别取待检分离株培养液50U1.加入上述稀择度血清及对照中.摇匀后37C孵育1h.取反应液及对照,放置载物玻片上暗视野显微镜下观察凝集情况,凝集滴度按原血清稀锋倍数X2计算.A. 3.1.2终点;S集满度的判定以出现+凝集(即视野中50%钩端蝶旋体被凝生)的群血清最高检择度作为终点凝维滴度,确定所网血清称.A3.2核酸检测可疑曲株进行核酸检测,检出饱用螺旋体特弁性核酸可判定为仙端螺旋体曲,见C.1和C2.附录B(规范性)钩端螺旋体病血清学检查B. 1标本要求需聚集患者急性期和恢发期双份血清进行检测,急性期血清应在首次检视患者时采取,血清分离后进行第次抗体检测,根据
7、患者的病程(一银为3w-1获得恢现期血清后,进行第:次抗体检测,两次间隔2w3w.来用显微镜凝集试验和酹联免疫吸附试脸进行检测。C. 2显微镜凝集试验(MAT)8. 2.1抗原的选择和制备格我国15群15型钩端爆旋体标准菌株接种于KOrtho或EYJH等适宜培养基中,28C培养5d-7d.暗视野显微镜检查,每400倍视野下不少于100条200条,运动活泼并无自凝者可作为抗原.B. 2.2操作步场!患者血清56C水浴灭活30Inin后,用生理拉水以I:50(早期患者血清)或1:100(恢笑期患者Im清)和I:400两个稀择度做定性试验,稀糅血清以及阳性对照、阴性对照及空白对照生理热水各取501.
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- 关 键 词:
- 螺旋体 病原学 检查 核酸 检测
