BCA蛋白浓度测定试剂盒完整版.docx

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1、BCA蛋白浓度测定试剂盒说明23225蛋白质化粉试剂盒：为500试管或5000微孔板的检测供应足终的试剂23227蛋白质化粉试剂盒：为250试管或2500微孔板的检测供应足峪的试剂试剂食组分：BCA试剂A,100Om1.（NO.23225产品中）或50Om1.（NO.23227产品中），碳酸钠,碳酸乳钠，：吨啥甲酸,酒石酸钠溶于0.1M辄氧化钠中。BCA试剂B.25m1.包括4%硫酸惴一次性标准白蛋白,2mgml.,IOIml.安根，包含2mgml,牛血清白蛋门（BSA）存在于0.9%盐和0.05%确氮化钠中，储存：以上试剂保持在室温下储存和装运留意：假如试剂A或试剂B在低加下运幼或长期谛存时

2、出现沉淀现怨,可以通过缓慢加温或轻轻搅拌溶液使沉淀物溶解。当试剂变色或确定微生物污染时请丢俅试剂食.书目介绍I打算标准试剂和工作试剂2打算试管3打算澈型版3故障检修4有关美国热电其他产品5附加信息5参考文献6介绍美国热电（ThCmIO）公司的BCA蛋白浓度测定试剂盒是基于二哇咻甲酸（BCA）通过比色检测和定量测定总近白的洗涤剂兼容航方。该方法通过碱性介质中的种蛋白结合了Cu2使.；削M乂变为Cul（缩二“反应）用一种含二奎琳甲酸的试剂选择性的比色法高敏感的比色杯中的Cul.这种测定方法的紫色色反应产物是通过BCA的两个分子和亚铜离子整合作用形成的.这种水溶性复合物在562nm处方强汲取峰.在大

3、的活性范围内（2O2OOOgm1.）几乎同Jfi白浓度增加呈践性关系。BCA法不是直正的终点的方法：也就是说.此终颜色接着发展，孵化之后.接新的颜色发展速度是足够慢以允许一起进行测定大fit样本.大分子结构的蛋白顺,肽粒的数收和存在的四个特定氨基酸（半胱（酸,胱级酸.色氨酸和酷氨酸）据说是与BCA形成衡色产物的缘由.因此,蛋白浓度的测中通常要卷照标准的个常地的蛋白质如牛血清白蛋白。一系列己知浓度的蛋白质稀铮液压为与之相近的未知蛋白质浓度测定打停的.因为每一个未知浓度的测定都须要基于标准曲线.假如须要将一个未知蛋臼精确定Jib选择一个与未知蛋白特性相像的标准蛋白是可取的.例如，当冽定免投琼蛋臼时

4、牛血清丙种球蛋白可以被当做标准蛋白。以下给出了两种检测过程：其中,试管程序须要一个较大的体枳（0.1名升）的蛋白筋样品.然而.因为它运用了一个样品比例为1:20的工作试剂（vv）.所以将扰物质的影响降到最小.在院处理程序供应了一样M处埋的.须要体积较小（10-25川.）的蛋臼鲂样品.然而,由于运用了样品比例为1:8的工作试剂（丫八），所以在克服干扰物质浓度时放提性降低，从而获得的检测水平较低,标准试剂和工作试剂的打算（试验程序须要的两个）A.打算总馨的BSA标准液表1为导向,打算一套生白质标准，稀i科标准的内容为,将一个盛在安依管中的标准BSA稀铎到几个干净的瓶子中,最好运用和样本s）相同量的

5、稀释剂.依据表1的建议:每1毫升的安能管中加入2扈克/开的BSA标准液对于打究一系列的标准桶锋液是足够的.每个稀株标准IR更三次也是足够盘的.-：打算稀理的BSA标准液标准试管协议和微型版程序的稀择方案（活性他困-202000gml.）管号稀样液体积BSA终浓度（Uum1.）0300的黑液2000B125375的原液1500C325325的原液I(XX)D175175的B管稀释液750E325325的C管稀糅液5(X)F325325的E管柿仔液250G325325的F管桶择液125H100100的G管稀样液25I-1000O=空白加强试管防议的稀粽方案（活性施困=5-250m1.）管号稀择液体

6、积BSA终浓度(UUm1.)A700100的原液250B100400的A管伟祥液125C150300的B管稀择液500WO400的C管稀糅液25EWO100的D管稀择液5F1000O=空白B：打算BCA的工作就剂（IR）1.总共须要的WR的体积可以通过以下公式计算出来：（标准液+未知液X（平行数目）（每个样品中加入的WR体积）=总共所需的WR体积例如：标准的试管程序有三个未知液，年个样品做两双取发：（标准液9m1.+未知液3m1.（平行数目2）（2m1.）=总共所需的WR体积48m1.留意：试管程序中每个样品管加2.0mlWR母型版程序中每个样品中只乐要加200ulWR2、WR的制备：RT方案

7、：RT2h（workingrange=20-2000ugml）3）EnhanCedPrOtoCol（加强方窠）；60C30min（workingrange=5-250ugml）阳意：每个试脸中都增加培育时间和温度,增加562nm的净吸光度,降低试剂的最低检测水平和方案的工作范围：运用水浴加热管要么是标准（37C培月）或是增加（60C培R）协议，运用强制的培有可能会因为拄传递不匀林使其在颜色变更上引进明显的误差.4、使全部管子冷却至室温5、分光光度计设定在562nm.当比色血中袋的是水时给仪器校李.前后，确保在10mm内测完全部样品的吸光度留意：因为BCA测定不是真正的终点，即使冷却到室温颜色还

8、会接者变更。然而，由于花室温下颜色变更速度比较慢,所以找如在10mi内测完全部试管的吸光度就不会引进明显的误差.6、全部的单个标准品与所测的样品垂复在562nm测得的吸光度都要减去在562nm测褥的全部空白标准品的吸光度平均使。微型板程序（样品：WR=1:8）1、用移液管移取25ul的WR到绿一个标准品与未知样品所在的微型板中（Workingrange=20-2（XX）ugml）留意:假如样品大小被限制为:每个未知样品和标准品只能运用IOUl（SamPIetoWRratio=1.20）.然而，被测敏的WOrkingrange在这种状况下拘被限制为125-2000ugml.2、好个孔中加200u

9、l的WR,JIJplateshaker混30s,使其沏底混匀3、封口，fr37iC30min4、冷却到室温5、用脚标仪测量在562nm或接近562nm的读数留意：1这种方法中波长在540-590nm的苞愕内都能被胜利的测玳2因为读板器运用的光城长度比分光光度计的比色皿要短,所以做蟹板程序须要运用样品比例比较大的工作试剂去荻得与标准试管程序相同的灵敏度.假如须要高于562nm的测要将培育时间增加到2h3）增加培育时间或样品工作试剂的体积比率，增M每个well在562nm的净测崎做，降低实际的用低测R水平和测脸的workingrange,只要年个标准样与未知样都被同等对待.这样的修改也是有益的.6

10、、全部的总个标准品与所测的样品更夏在562nm测得的吸光险都要减去在562nm测得的全部空白标准品的吸光度平均侑。7、打算一个标准曲线通过绘制用个标准BSA在562nm测砧的相对于空白比照的吸光度平均值.它ug/ml的浓度.运用标曲去测我每一个未知样品的蛋白质浓健.的意：假如联系微型板读数器运用拟合的曲线究法.一个有四个参数的或最合适的曲戏将供应比纯线性状态更精确的结果,假如用手绘制这个结果，一个点-分曲线将比戏性更加适合标准点。故障检修问遨可能缘由解决方案在任何管中都无颜色样品包含铜整合剂透析，脱盐，或稀择样品.增加工作试剂中铜浓度（例如,运用,试剂A:B50:2）运用的产品23215从样品

11、去除干扰物质空白汲取是可以的,但是标准和样本比预期的显示更少颜色强酸性或版性缓冲液变更了工作试剂的PH透析，脱盐，或稀择样M.瓠色在错误波长下被测量确定在562nm波长下泅吸光度样品的颜色比预期的深蛋白浓度太高稀稀样品样品包含脂质或腑蛋白添加以削减脂质干扰运用的产M23215从样从去除干扰物质全部试管（包括空白）都是暗紫色缓冲液中含有还原剂透析或稀择样品.运用的产品23215从样品去除干扰勒旗线冲液中含有藐基镶冲含有生物胺（儿茶附胺须要在不同波长FiWft颜色分光光度计或脚标仪没有562nm/光涔从540nm到59Onm颜色可以在任何波长下被测IftM然标准曲线的斜率和整体测求的灵敏度将削减A

12、,干扰物国某些物质干扰BCA检测是已知的，包括潜在的还原剂，林合剂，强酸或强破.因为他们可以卜扰估整蛋白质斑分钟浓度，作为样品缓冲液的殂份应避开下列物顺：抗坏血酸EGTA铁不纯的蔗糖儿茶的股不纯的甘油脂质色飒酸肌酸酊过氧化氢蜜二糖酪氨酸半肮软酸醍脂炎笨的旗酗尿酸其他物质对BCA法松测蛋白用有较少程度的干扰.并且这也在原来的样本中低于泞定浓度只行很小的影响（可以容忍）.很多物质的最大兼容的浓度在标准测试管协议中被列出.表2（见说明的最终一页）.物质是妆容与标准测试管协议中指定的浓度，假如蛋白浓度的估计的误差是由物质的存在所造成将会小于或等于10%。在好个试验之前，这些物质都会用现配的WR进行测试

13、。空白校正的宰562nm的吸光度测量值（100Ogm1.白蛋白标准品+物质）将会同0.9%生理盐水中精确配制的标准品化562nm出的净吸光度进行比较.样品：WR为1：8（Wv）的微孔板过程中最大故容浓度将比较低.B.消退或削减干扰物质影响的,策略BCA蛋白含量:测定中干扰物的影响可以用以卜几个方法消退比克服，通过透析或凝胶过浊去除干扰物质. 稀择样M,直到不再有干扰.这种策略只在起始蛋白质浓便足够多余桶棒后仍在检测活性范阳之内是有效的， 用丙蒯酸或三氯乙酸CrCA）沉淀样品中蛋白质，液体包含干扰勒麻将被丢弃，缴白沉淀很简单在超纯水中溶解或干脆用珊性BCAWR溶解.这一方案的具体漉程可从我们网站

14、狭行.另外，23215号产品将被运用（见相关PierCe产品）. 适当的埴加WR中钢的崎（打豫WR试剂A:B为50:2或50:3J这将削减剂螯合剂的干扰留意:为最大限度的精确度,蛋白质标准品必禽和样品（三）同样处理.有关美国热电其他产品1504196孔板100pkg15075试剂水库200/pkg.1503696孔板密封带IO（NPk&23209标准门蛋白安甑2mgm1.IOXl厘开安瓶,包含牛血清白蛋白23208预稀林的蛋臼侦检测标准品；牛血清白Ifi白集合，7X3.5m1.23212牛伽玛球蛋白标准品2mgml,10X1m1.安Sfe23235微型BCA蛋白检测试剂盒工作藕用为0.520g/m1.