霍乱弧菌的分离与鉴定、霍乱诊断的相关实验技术、鉴别诊断.docx

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1、附录A（规范性）霍乱弧菌的分盅与鉴定A.1标本的采集患者的粪便、呕吐物或（和）肛拭子为适宜采集的标本.水样使或呕吐物采样St一股为1m1.-3m1.成形便采取指甲大小的蕤6：IIHK干可用直肠棉状或采使管曲肛门插入直肠内3Cm5cm（幼儿约2cm-3cm）处旋转后取出，以看到棉拭子上沾有粪便为佳。也可采集患不口常生活物品的涂抹拭子标本和家居环境的样本。A.2标本的送检果得的标本应立即接种F培养基，不能立即接种的，应放入PH8.49.2的减性蛋白陈水或义睹：氏保存液或插入Caiy-BkIir半固体保存培养基中,放置于冷藏箱内保存、送检。粪便或呕吐物等标本与运送培养基或增菌液的比例约为EO.肛拭子

2、他插入5m1.运送培养基或增菌液中.A.3分离培养A.3.1直接分离培养对急性期忠者水样便标本在进行增苗培养的同时，可取-接种环或用股拭产宜接划线接种强、弱选择性平板各一个，宜37C培养18h24h.A.3.2增前分离培养标本接种于pH8.49.2的碱性蛋臼脓水中置37C增菌6h8h后，从菌股下表层取一接种环培养物划税接种于强、如选择性平板各一个，跣37P培养18h24h,必要时可取0.1ml.一次增衡的表层培养物于5m1.的新鲜碱性强臼豚水中进行：次增苗培养，也可选用分离效果较好的蛆崩显色琼脂。A.3.3选择性培养基常用强选择性培养班包括庆大毒素琼脂、硫代硫酸盐柠檬酸盐胆盐或助（TCBS）琼

3、膈和四号球厢等。弱选择性培养基一般使用碱性营养琼脂等.A.3.4霍乱皿菌菌落特征A.3.4.1碱性营养琼脂一乱弧菌今赫性营养琼脂上37-*JR目秘乱弥蔺拟态弧荫副溶血贝荫创伤溶笈JtBi何弧菌弗尼斯贝荫野鱼孤苗东利财强丽麦氏萤而辛辛那臾弧的ffi乳我*A-.-林-史芽他+-+.D-IIJSB4-*诙琳-+w1,网公的M-.+-轩舞:他-+-+.7+-水物素.-*IVltI家+-不斑脉中长在同量水生试0%NaC+-3%NaCI+6%NaO+/-+A*+/-+*/-*+A8%NaCI4?*A*10%NaCl-林-*-07129IftAXIOWlS-SRSRRRSRSRR性50gS3SSSSSSSS

4、SSS注：SttlS:Rtl.,芹分0139样在乱W苗为抗性R.附录B(规亮性)霍乱诊断的相关实验技术1.1 8乱弧菌特异性核酸PCR检测8.1.1检测能标基因CT幸素是很乱弧苗的主要致病因子，对其编码法因8的松测可用于对般乱弧的产毒株的确认，瑞株血清群的检测也可用PCR方法如增Ol群和0139群霍乱弧赭脂多胞特异性基因力来确定.种特异性基因位点的PCR扩增也可纳入很乱弧曲的检溯签定中,检测应在符合PCR检测要求的实脸室中进行，实时英光PCR方法较普通PCR操作更简便,可避免交叉污染.8. 1.2样品核酸制备B. 1.2.1粪便嗯吐物或肛拭子标本用商品化的核酸提取试剂盒提取费便、呕吐物或肛拭子

5、标本中的细菌核酸作为PCR检测模板,标本前处理和核酸提取操作方法参照相应武剂向说明书。8.1.2.2疑似菌落挑取庆大毒素等选择性琼脂或普通营养琼脂等平板上的I个2个可疑的落，以Im1.生理盐水桶锌后，用核酸提取试剂盒提取DNA作为PCR检测模板，另一个皆代方法是将1个2个可疑的落于2001.纯水中煮沸Iomin,冰浴5min,100OONmin-12OOOr/min4T离心5min,取21.-31.上清液作为检测模板.B.1.2.3碱性蛋白陈水母苗培养液从墙曲培养液液体表面前膜卜缘处取Im1.-2m1.的培养液，100rmin-l20rmin离心3min,弃上清沉淀用Im1.纯水垂悬.用核酸提

6、取试剂盒提取DNA作为PcR检测模板.另一个替代方法是沉淀用Im1.纯水更悬、再离心、洗涤2次后,加1001.2OQH1.纯水奠悬煮沸Iomin,冰浴5min,100OOrZmm-12(X)Ormin4匕而心5min,取上消液作为检测的模板.B.1.3普通PCR检测B.1.3.1CT毒素基因检测检测CT毒泰龙因SS8的参照引物序列见表B.1,如增参数：预变性94C,Smin：94C.30s.60C.30s.72C,30s,30个循环：最后72CiI伸7min.B.1.3.201/0139群发乱弧菌的多糖4寺异性r)h基因检测扩增O1.gI39群的乱弧曲脂多题特异性砂基因的参照引物序列见表B.I

7、,扩增参数；预变性94.5min：94C.30s.55T.30s.72C.45s.3()个循环：最后72C廷伸5min.8.1.3.3霍乱皿函种特异性MyA基因检测扩墙很乱弧尚种特异性UyA基因序列的参照引物序列见表氏1,扩增参数:预变性94r.5min；94C.30s.55r.30s,72,C.45s.30个循环：最后72C延伸5min.表Bl看乱弧菌普通PCR检测叁照引物检测基闪引构石你核汗酸序列(5寸)产构大小pctxRCUA-PICTCAGACGGGATrTGTTAGGCACG302CIAAP2TCrATC150TAGCCCCrAnAcGOlrfbOIrfbPIGECACTGA八CAGATGGG192Olrfb-P2Ggtcatctgtaagtacaac检测雄闪用物名称悔甘?F广列5-3,)!“的大小Jbp01399OI3MbPlAgcctctttattacgggtgg449O139rlb-P2GTCAAACCCGArCGTAAAIiGMyAhlvPIGCAAACAGCGAAACAAATACC497hlyAP2TccaccccaccagtcaccB.1.4实时荧光PCR检测B.1.4.1商品化实时PCR检测试剂盒选择使用经国家药品监籽管理机构批准的商品化实时荧光PCR检测试剂B.