临床ELISA技术操作要点.docx

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1、临床E1.1.SA技术操作要点优质的或剂，良好的仪器和正确的操作是保证E1.ISA检测结果准确可靠的必要条件。E1.ISA的操作因固相载体的形成不同而有所差异，国内医学检验一般均用板式点。本文将叙述板式E1.ISA各个操作步骤的注意要点，珠式、管式及磁性球E1.SIA,国外试剂均与特殊仪器配合应用，两者均有详细的使用说明，严格遵照规定操作，必能得出准确的结果。标本采取和保存可用作E1.ISA测定的标本十分广泛，体液（如血清）、分泌物（唾液）和排泄物（如尿液、粪便）等均可作标本以测定其中某种抗体或抗原成份。有些标本可直接进行测定（如血清、尿液），有些则需经预处理（如粪便和某些分泌物。大部分E1.

2、ISA检测均以血清为标本。血浆中除尚含有纤维蛋白原和抗凝剂外，其他成份均同等于血清。制备血浆标本需借助于抗凝剂,而血清标本只要待血清自然凝固、血块收缩后即可取得。除特殊情况外，在医学检验中均以血清作为检测标本。在E1.1.SA中血浆和血清可同等应用。血清标本可按常规方法采集，应注意避免溶血，红细胞溶解时会释放出具有过氧化物酶活性的物质，以HRP为标记的E1.ISA测定中，溶血标本可能会增加非特异性显色。血清标本宜在新鲜时检测。如有细菌污染，菌体中可能含有内源性HRP,也会产生假阳性反应。如在冰箱中保存过久，其中的可发生聚合，在间接法EIJSA中可使本底加深。般说来，在5天内测定的血清标本可放置

3、于4C,超过一周测定的需低温冰存。冻结血清融解后，蛋白质局部浓缩，分俗不均，应充分混匀宜轻缓，避免气泡，可上下颠倒混和，不要在混匀器上强烈振荡。混浊或有沉淀的血清标本应先离心或过滤，澄清后再检测。反复冻融会使抗体效价跌落，所以测抗体的血清标本如需保存作多次检测，宜少量分装冰存。保存血清F1.采集时就应注意无菌操作，也可加入适当防腐剂。试剂准备按试剂盒说明书的要求准备实验中需用的试剂。E1.1.SA中用的蒸储水或去离子水，包括用于洗涤的，应为新鲜的和高质量的。自配的缓冲液应用pH计测量较正。从冰箱中取出的试验用试剂应待温度与室温平衡后使用。试剂盒中本次试验不需用的部分应及时放I可冰箱保存。加样在

4、E1.1.SA中一般有3次加样步骤，即加标本，加随结合物，加底物。加样时应将所加物加在1.EISA板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可溅出，不可产生气泡。加标本一般用微量加样器，按规定的量加入板孔中。每次加标本应更换吸嘴，以免发生交叉污染，也可用一次性的定量理料管加样。有此测定(如间接法E1.ISA)需用稀释的血清，可在试管中按规定的稀释度稀释后再加样。也可在板孔中加入稀释液，再在其中加入血清标本，然后在微型震荡器上震荡1分钟以保证混和。加酹结合物应用液和底物应用液时可用定量多道加液器，使加液过程迅速完成。保温在E1.ISA中一般有两次抗原抗体反应，即加标本和加海结合物后。抗原抗体反应的完

5、成需要有一定的温度和时间，这一保温过程称为温育(incubation),有人称之为孵育,在E1.ISA中似不恰当。E1.ISA属固相免疫测定，抗原、抗体的结合只在固相表面上发生。以抗体包被的夹心法为例，加入板孔中的标本，其中的抗原并不是都有均等的和固相抗结合的机会，只有最贴近孔壁的一层溶液中的抗原直接与抗体接触。这是一个逐步平衡的过程，因此需经扩散才能达到反应的终点。在其后加入的酶标记抗体与固相抗原的结合也同样如此。这就是为什么E1.ISA反应总是需要一定时间的温育。温育常采用的温度有43“C、37C、室温和4C（冰箱温度）等。37C是实验室中常用的保温温度，也是大多数抗原抗体结合的合适温度。

6、在建立E1.ISA方法作反应动力学研究时，实验表明，两次抗原抗体反应一般在37C经1-2小时，产物的生成可达顶峰。为加速反应,可提高反应的温度，有些试验在43C进行，但不宜采用更高的温度。抗原抗体反应4C更为彻底，在放射免疫测定中多使反应在冰箱中过夜，以形成最多的沉淀。但因所需时间太长，在E1.1.SA中一般不予采用。保温的方式除有的E1.ISA仪器附有特制的电热块外，一般均采用水浴，可将E1.ISA板置于水浴箱中，E1.ISA板底应贴着水面，使温度迅速平衡。为避免蒸发，板上应加盖，也可用皇料贴封纸或保鲜膜覆盖板孔，此时可让反应板漂浮在水面上。若用保温箱，E1.ISA板应放在湿盒内，湿盒要选用传热性良好的材料如金属等，在盒底垫湿的纱布，最后将E1.ISA板放在湿纱布上。湿盒应先放在保温箱中预温至规定的温度，特别是在气温较低的时候更应如此。无论是水浴还是湿盒温育，反应板均不宜叠放，以保证各板的温度都能迅速平衡。室温温育的反应，操作时的室温应严格限制在规定的范围内，标准室温温度是指20-25C,但具体操作时可根据说明书的要求控制温育。室温温育时，E1.ISA板只要平置于操作台上即可。应注意温育的