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1、ICS11.040.30CCSC30T/CSBM体标准TCSBM0050.42024创面修复材料有效性评价第4部分：体外微血管形成试验评价方法Effectivenesseva1.uationofwoundrepairmateria1.sPart3:1.nvitromicroangiogenesiseva1.uationmethod2024-05-14发布2BHM)1找中国生物材料学会发布早期的创面愈合材料为淬通无菌的敷料,主要起到物理隔齿保护创面的作用.的若生物材料的不断发展，具有组织再生能力的材料不断出现，这叫材料不仅具有保护创面，而H.具有促诳创面细胞再生迁移，加速创面愈合速度和提高创面愈

2、合痂扇的作用，I1.前评价创面材料的有效性主要是评价对细菌的隔离作用，尚无从细胞水产评价材料促进创ifd愈合的方法.本文件栗用体外细胞培养的方法，评价材料对做血管形成的影响,评价材料促进创面愈合的有效性.开放伤口愈合过程中伤口收锦占主要地位，-殷可达81EM低糖培养JB将细胞重新混姓，取适状混匀的细胞怂液于细胞培养精内，在37C、於CO2细胞培养箱中继续培养.传代比例为1:4,2天一3天传代。1.1.1.3 细胞冻存细胞消化后，K）OOnhin离心3mia加入冻存液将细胞混匀，J10U闻胞悬液用细胞计数仪计数，然后将混匀的细胞悬液放入冻存管中，得管Im1.冻存密度为IX1.o1.,m1.7x1

3、.（Vm1.冻存管上应标明冻存细胞的名称、密度、代数以及冻存人和冻存时间.冻存细的先4C放置10mm,再20P放置30min,然后-80C过夜，梯度降温后将细胞转移至液氮中保存.5.4.2小成试小管形成试验步骤如下：a）将基脑胶放入冰箱4C过夜缓慢融化。怆头、24孔板等放入冰筒-20C预冷：b）将基质胶以每孔20。P1.缓慢加入预冷的24孔板中，避免气泡产生，注意操作过程中手持EP管上方,手心不应接触EP:c）将铺有基质胶的24孔板放入冰箱IX?外置15min,然后转移至37七培养箱中外置30min,使其凝愠：d）待细胞融合至80%左石时将细胞消化、离心并分别用试脸液和空白财照液重悬细胞,随后

4、细胞以IXIoVm1.加入24孔板中，M1.1.m1.,3个及孔。放入恒温细胞培养箱中维埃培养，分别在3h、6h、9h观察小管形成情况：C）将细胞按照d）步骤铺板，在:6h时将细胞固定免疫荧光染色,显微僮下观察小管形成情况，并拍照，【mageJ计亢成管数量，观察浸提液对血管形成的影响.6结果分析6.1 附录A给出了体外微弱管形成试验方法的实例.6.2 小管形成试验结果：在观察时间内血管形成情况的描述，并给出显微镜下图片结果。6.3 免疫荧光染色结果：评价由管网形成的数玳和血管形成的总长度，采用统计学评价方法，评价材料促进血管形成的效果，并给出免疫荧光染色的结果图片。经统计学分析试险组和空白时照

5、组比较fX005则认为该材料具有促进血管生成的作用,否则材料没有促进血管生成的作用.附量A体外Ik1.Egtm例A.1Mx试旗联材、细胞系6.X1M试验器具如卜7a）二氧化碳细胞培养箱：b）恒温水浴插床；C）高压蒸汽灭菌糊：d）倒置荧光显微镜：e）细胞计数仪；f）恒温水浴摇床：g）酹标仪:h）电子天平：i）液短就：j）冷冻离心机：k）T25细胞养瓶：D24孔板;m）基质股；n）ImageJ图像处理软件。6.3.2试剂M材试验试剂和耗材如下:a）MIiM低融培养基：含10%胎牛血清：b）无血清培养基；c）磷酸缓冲液（PBS）;d）0.25%腴蛋白利。6.3.3缰胸系EA.1IY926细胞.外阳.

6、自带细胞STR鉴定报告.A.2品A.2.1MAtK以消化道创面保护胶为试样,在无i陶状态下,按以下条件制备浸提液：a）浸提温度：37C1;b）一提时间:24h2h;c）浸提介质：无血清培养基：d）没提条件：120Ivmin授床中段藩：e）样品和浸提介质的比例：按照GB16886.122023中表1的规定进行.A.2.2空白对IeMEM低楣培养基,37,120r/min摇床中震荡24h2h.A.3MMMA1EA.HY926iM(M#按5.4.1进行。A-3.2小成试It按5.4.2进行.A.4Ji1.彩成试果A.4.1小各组细胞分别加入处理后的样品重悬.随后接种到铺板基质股的24孔板中培养9h.

7、观察各组血管结构在不同时间的的生成情况,细胞刚接种时大多呈圆形，随着培养时间的砥长.细胞开始长舟伪足.与相邻细胞相连：3h时.部分细胞由Ia膨伸展为长极M部分细胞间逐渐建立连接：6h时,细胞多数于周闱细胞建立连接.线样结构增多且细胞逐渐形成管状N格结构：防首时间的延长,形成的线样结构逐渐断裂，细胞逐渐城集，小管样结构数量减少。XK)O显微镜下不同时向小管形成情况见图A.1.阳6h9h说明：A空白对氯组培养3h;B臼对!幽附猴忙C空白对然照养9h.a雌缈傣Itb试验组培粼kcW三1.9h.KA.1X1.OOM-不同时何小也成情况A.4.2免疫袋光染色结果管状形成反映了人脐修脓内皮细胞的体外小管形成能力，样品浸提液与对照组相比，血管形成数目和小管总长度均有统计学差异(P000).免发荧光结果可以发现,对照组细宽为长梭形，但细胞之间未建立紧密连接.样品如细照之间砥束相连.形成小管状。综上，水凝胶能够促进血辟形成，且形成的血管网状结构也更加成熟.免疫荧光染色注果见图A.2.0)SA.2免知眈染色结果A.5绐论样从能忏效促进低值管形成,且在6h时小管形成效果报佳,血管数量增加,