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1、各操作步骤试剂与缓冲液的配制破裂法提取质粒1、1.B培养基(配制1)腴化蛋白陈1%酵母提取物05%NaC1.1%(pH7.0)方法：分别称取胰化蛋白腺10g,醉母提取物5g、NaCI1.Og,溶丁95OmI去离子水中，加热直至溶质全部溶解。用5mo1.1.-NaoH(的0.2m1.)调PH至7.0用去离子水定容至11.在0.1MPa高温下蒸汽灭菌20min.(若制备固体培养基定容前加入2%的琼脂，加热使其溶解，调PH至7.0。再用去离子水定容至在0.1MPa高压下蒸汽灭菌20min.)2、喊裂解溶液I(配制100m1.)菊简犍5011uno1.1.Tris-C1.(pH8.0)25mmo1./

2、1.EDTA(pH8.0)10mmo1./1.方法：分别称取0.9909g葡萄械、0.3029gTris、0.3722gEDTA过于100m1.的烧杯中，加入80m1.的蒸偏水使之溶解，用浓盐酸调PH至8.0后转入容量瓶中定容至100mI。在0.1MPa压力下灭菌15min,装于棕色试剂瓶中保存于4C.3、碱裂解溶液11(配制100mI)0.005mo1./1.NaOH1%(mV)SDS方法：分别称取002gNaOH、IgSDS置于100mI的烧杯中，加入80m1.蒸铸水使之溶解，转入容量版中定容至100m1.装于棕色试剂瓶中，室温保存。注：碱裂解溶液H要现用现配制，室湿下使用。4、碱裂解溶液

3、川(配制100m1.)5mo1.1.乙酸钾60.0m1.冰乙酸11.5m1.H2O28.5m1.方法：用量筒分别量取5mo1./1.乙酸钾60.0m1.5mo1./1.乙酸钾的配制(100m1.)：称取29.4420g乙酸钾置于100mI的烧杯中，加入80m1.蒸镭水使之溶解，转入容量瓶中定容至100m1.、11.5m1.冰乙酸于100m1.的容量瓶中，加蒸储水定容至100m1.,装丁棕色试剂瓶中保存于4C。用时置冰浴中。5、STE溶液(配制IOm1.)0.1mo1./1.NaC1.10mmo1./1.Tris-C1.(pH8.0)1mmo1./1.EDTA(pH8.0)方法：分别称取0.05

4、84gNaC1.0.0121gTris,0.0037gEDTAS50m1.的烧杯中加入5m1.的蒸饱水使之溶解，用液盐酸调PH至8.0后转入容量瓶中定容至Iom1.装于棕色试剂瓶中，室温保存。6,TE(PH8.0)缓冲液(配制IOmI)100mmo1./1.Tris-C1.(pH8.0)10mmo1.1.EDTA(pH8.0)方法：分别称取0.1211gTris、0.0372gEDTA于50m1.的烧杯中加入5m1.的蒸储水使之溶解，用浓盐酸谢PH至8。后转入容量瓶中定容至Iom1.分装后在0.1MPa高压下蒸汽灭菌20min.装丁白色武剂瓶中室温保存。7、1mg/m1.胰RNaSe(配制2m

5、1.)用201仃9.6)溶解20粗制胰RNaseI,置于EP管中保存于4C.注:TE(pH7.6)缓冲液(配制10m1.)100mmo1./1.Tris-CI(pH7.6)10mmo1.1.EDTA(pH8.0)方法：分别称取0.121IgTris、0.0372gEDTA于2只50m1.的烧杯中,再分别加入2m1.的蒸储水使之溶解，用浓盐酸分别调PH至7.6和8Q.将两者混匀后转入同一容量瓶中定容至Iom1.分装后在0.1MPa高压卜蒸汽灭菌20min,装丁白色试剂瓶中室温保存。感受态细胞的制备与转化1、0.1mo1.1.CaC2(配制100m1.)方法：称取1.1098gCad2巴于100m

6、1.的烧杯中，加入80m1.蒸储水使之溶解，再转入容量瓶中定容至100m1.用0.22四滤落过滤除菌，装于白色试剂瓶中贮存于4To2.MgebCaC：溶液(配制100m1.)80mmo1./1.MgCI220mmo1./1.CaCI2注：80mmo1./1.MgCI2(rt!100m1.)：W1.6264gMgCI2.置于100m1.的烧杯中,加入80m【蒸馀水使之溶解，转入容量瓶中定容至100mI,装于白色试剂瓶中室温保存.20mmo1.儿CaCy配制100m1.)：置于100n1.1.的烧杯中，加入80m1.蒸饱水使之溶解，转入容量瓶中定容至100m1.,装于白色试剂瓶中室温保存。用时按比

7、例混合。琼脂糖电泳1, 1%琼脂械(配制100m1.)称取1g琼脂糖F100mI蒸储水中，搅拌混匀。2, TriS-乙酸缓冲液(TAE)50(11.)242g57.1m1.TriS破冰乙酸0.5mo1.1.EDTA(pH8.0)100m1.方法：称取242gTris碱，用量筒量取57.1m1.冰乙酸、100m1.0.5mo1./1.EDTA(PH8.0)置于100Om1.的烧杯中，使之溶解后转入容量:瓶中定容至1000m1.装下白色试剂瓶中空油保存。注100m1.0.5mo1./1.EDTA(pH8.0)休城制：称取18.162gEDTA,ST1.OOmI的烧杯中，加入80m1.蒸愉水使之溶解，在磁力搅拌罂上剧烈搅拌。用NaoH调节溶液的PH值至8.0,转入容量瓶中定容至100m1.装于白色试剂瓶中高压蒸汽灭菌后室温保存。3、6加样缓冲液(配制IOmI)0.25%(m2)渔酚蓝40%(m2)蔗糖水溶液方法：分别称取2.5g说酚蓝，4g蔗糖于50m1.的烧杯中加入IOm1.的蒸饱水使之溶解，混匀，装F棕色武剂瓶中贮存于4C-附:称取0.25g摸酚蓝定洛于100mI95%乙醇中，即得0.25%溟酚薇.使用时一般用0.1M氯氧化钠溶液调至微碱性。4、湿化乙锭