T_CSBM 0050.3-2024 创面修复材料有效性评价 第3部分：刺激因子屏蔽评价方法.docx

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1、ICS11.040.30CCSC30T/CSBM体标准TCSBM0050.32024创面修复材料有效性评价第3部分：刺激因子屏蔽评价方法Effectivenesseva1.uationofwoundrepairmateria1.sPart3:1.nvitroirritantsbarriereva1.uationmethod2024-05-14发布中国生物材料学会发布前言II引吉!.!IIII越围!.12规范性引用文件I3术语和定义I4刺激物浓度确定试验I5物理屏蔽细胞活力试脸36物理.屏蔽细胞迁移试验5参考文献7本文件按照GB,b1.1-2020标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规

2、则的规定起草.本文件是17CSBM0050-2024受创面修发材料有效性评价3的第3部分。包括以下部分： 第1部分：水溶性材料体外评价方法： 第2部分：水不溶性材料体外浸提液评价方法： 第3部分：刺激因了疥蔽评价方法： 第4部分：体外微曲音形成试验评价方法： 第5部分：体外细胞粘附和增殖直接接触评价法： 第6部分：动物食管创面模型促修笈愈合评价方法；一第7部分：动物胃创面模型促修更愈合评价方法： 第8陆分：动物肠道创面模型促修史愈合评价方法： 第9制分：动物皮肤创面模型促修复愈合质破评价方法.请注愈本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的击任。本文件由中国生物材料学会提出

3、。本文件由中国生物材料学会团体标准化技术委员会归口。木文件起草单位：杭州英健牛物科技有限公司、中国食品药品检定研究院、四川大学。本文件主要起草人：戴建英、韩倩倩、梁洁、于栋杰、高欣怡、王良龄、王涵、徐翁、李嫦、王春仁、王萤.Y期的创面愈合材料为普通无菌的敷料，主要起到物理隔而保护创面的作用.1行生物材料的不断发展,具有组织再生能力的材料不断出现.这些材料不仅具有保护创面而且具有促进创面细胞再生迁移，加速创面愈合速度和提高创面愈合质用的作用.目前评价创面材料的有效性主要是评价对细赭的附肉作用，尚无从细跑水平评价材料促进创面愈合的方法,创面脩发材料主要包括水溶性材料和非水溶性材料。本文件来川物理隔

4、熟模型和体外细胞培养的方法，评价材料对细胞增附和迁移的影响，确定材料物理隔离作用的有效性，通过体外物理防护模型试5金评价材料对各种刺激因子如丹酸、肖蛋白梅、胰蛋白梅、就化物、内毒索等物侦的隔离作用，在保护材料的作用K,细胞增殖试验应显示细胞处P存活增殖状态，细胞迁移试胎在有保护材料存在时显示细胞迁移作刖o本文件采用TmnSWeI1.细胞培养技术评价创面传或再生材料的解蔽效果.创面修复材料有效性评价第3部分：刺激因子屏蔽评价方法1CT本文件规定了创面修红材料体外评价的刺激物浓度确定试的、物理屏馥细胞活力试验和物理屏薮细胞迁移试验。本文件适用于水凝胶或固态创面性笈牛.物材料屏蔽保护创面细胞活力和迂

5、移效果的评价。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规葩性引用而构成本文件必不可少的条款,其中，注目期的引用文件，仅该R期对应的版本适用于本文件：不注F1.期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB16886.5-2017医疗器械生物学评价第5部分：体外细胞毒性试验T/CSBM0050.1创面修发材料有效性评价第1部分：水溶性材料体外评价方法3*wwxT,CSBM0050.1界定的术语和定义适用于本文件。,细胞活力CenViabi1.ity总细胞中活细胞所占的百分比。3.2剌激物irritants可致眼、皮肤、呼吸道黏膜、消化道黏膜发生可逆炎性反应的物质。4.1 三a将

6、刺激物溶解在培养基中，配成不同悌哎己知浓度的样品，按照GB168865测定刺激物不同浓度下的细胞海性，确定刺激物存活率40%.50%和60%的浓度，4.2 ff*、WRImh三Mv4.2.1 M试验器具如下：a）二氧化碳细胞培养箱：b）恒温水浴摇床：O高压蒸汽灭菌锅：d）例置荧光显微镜：C）细胞计数仪：0恒温水浴插床：g）陶标仪：h）电子天平：I）液翅麻：j）冷冻离心机：k）96孔板；1）细胞培养瓶或细胞培养皿.4.2.2 试剂和耗材试脸试剂和耗材如卜;a）含10%新生胎牛血清DMEM低糖培养茶（含10%FBSDMEM低柄培养味）；b）二甲基亚W.（DMSO）;C）异内醉：d）高密度聚乙烯。4

7、.2.34.2.3.1 试验可使用的细胞系如I：a)b)。山e)成纤维细胞；皮肤上皮细胞：食管上皮细胞：目黏腴上皮细胞：肠黏腴上皮细胞.4.23.2对于用于不同部位的修史材料选择合适的细胞系，如用于皮肤的修复材料可用皮肤细胞,用于食管的材料可选择食管上皮细胞.4.2.4JMK物试验可使用的刺激物如下:a）盐酸：b）蛋白曲:c）胰蛋白酪d）过氧化氢；C）细菌内毒素：0其他.4.3 MM*4.3.1 剌谶物梯度溶液准确称取刺激物溶解在含1VFBSDMEM低糖培养墙中，配置成不同梯度浓度的刺激物，过泄除的低温保存备用。根据样从现有的细胞毒性数据，配式K）个不同悌馁浓度的刺激物。4.3.2 IWtti

8、三计算直径为ICm的高密度聚乙烯双面的面积,按3CmWn1.加入含1仇FBSDMEM低糖培养基，37C、120r/min摇床中浸提24h.取上清液使用。4.3.3 PSttMM1.取适fiU)XSO加入含10%FBSDMEM低检培养基内,制备10%DMSo溶液.37,120r/min播床中段荡4.3.4 空白对照含IOFBSDMEM低犍培养基，37C、12(Wmin摇床中能荡24h,4.4 试方法按照GBT16886.52017中附录C规定的MiT胞毒性试验方法进行,处理条件、检测模型、观察时间按表I进行，试验设置空白对照组、阴性对照组阳性对照组、刺激物组，每个试验批设式6个复孔.将复苏好的成

9、纤维细胞传至两代以上呈时数生长期时.按照IXIOS个An1.密度制备细胞悬液，每孔加入1001.细胞悬液.然后接种到96孔板内,放入二飙化碳细胞培养箱在37C下培养24h.移去旧培养基.按照试脸设置加入对应培养液,继续培养24h后,在显微镜下观察每组细胞形态,弃去卷组培养液后加入Imgm1.5()1.MT溶液.放入细胞培养箱中好育3h后弃去孵育液.加入100U1.异内酹，用振荡器上振荡使薇紫色结晶充分溶解混匀,在脚标仪上检测570nmH1650nm波长的吸光度值并按照式(1)计算细胞存活率。P1.1AUM性试试验分班处理条件试照模型观察时间成蚊方法空白对照纲10MBSIftIKM低於培祚坛细胞

10、系37七、5C()1共培於24hWr法明性对那祖充室收聚乙惴含IOMTJSWEX低|珞祚堪阳性对照机IgwIS。畲IMEBS制用低能培养妫剌激物组不同浓度件激物溶液X1.O0%式中：R细胞相对存活率，%；A5XMn一阴性对照殂在57Onm处的平均吸光度：A650m一阴性对照组在65Onm处的平均吸光度：B；2顺阳性对照组在5?Onm处的平均吸光度:B5011un一11性对照祖在65Onm处的平均吸光度.4.5 试用JM浓ft的配根据细胞满性试验结果，做刺激物浓度和细恂毒性关系曲线，选择细胞有性存活率40%、50,60的3个浓度用于物理加蔽细胞活力和物理屏蔽细胞迁移试验.若试史结果的细胞毒性存活

11、率未能达到以J1.要求,宜进-步增加浓度或降低浓度重新进行细胞毒性试验.5.1*9采用TranSWC1.1.细胞培养技术评价创面修更再生材料对胃酸、胃蛋白悔、胰蛋白胸、过氧化乳、细曲内毒素等刺激因子屏障作用,物理屏藏保护试验模式如图I所示。在有保护材料屏蔽的情况卜W以避免刺激因子而细胞的剌激和毒性作用，细胞可以生长良好，而在没有保护的情况下细恤生长被抑制或细胞死亡。实验组对照组b）未加材料S1材料屏保护试IMIfiMf1.B5.2 m、w5.2.1 具试验器具如下：a）二氧化碳细胞培养箱:b）恒淑水浴摇床：O高压蒸汽灭菌锅：d）倒置荧光显微慎：e）细胞计数仪；0恒温水浴摇床：g）前标仪：h）电

12、子天平：）液氮堵：j）冷冻离心机；k）24孔板：I）TnmSWdI孔板；m）96孔板。5.2.2试驶试剂和耗材如下：a）含10%新生胎牛如消DMEM低糖培养基（含10FBSDMEM低世培养基）；b）CCK-8试剂.5.2.3 细星系I11J4.2.3。5.3按45确定的浓度.按4.3.I配制3个浓度的剌激物溶液.5.4 试Ift方法按照表2规定将处于对数生长期的细胞按照1X10,个Zm1.的细胞密度铺于2矶板内,每孔加入Im1.j个IZ孔，试脸组的TranSWC1.1.孔板中加入0.2m1.保护胶使其厚度为1.OmmTSmg空白对照加不做处理，分别向每组中加入3个不同浓度的刺激物观察2加、48

13、h72h细胞炳殖情况，的标仪下检测45Onm的吸光度，按照式(2)计芽细胞存活率，评估创面修史材料屏蔽保护细跑活力作用。我2a屏曲活加C1.t避险分现处理条件试验模皇观察时间试验方法空白对照组无材料组胞系2体、48h.72hCKKT法试验组有材料p.XagXoo,(2)S式中：R一一细胞存活率，%;A450m一试脸组在45Onm处的平均吸光度：BISOm一空白对照组在45Onm处的平均吸光度.5.5Ia果分析采用统计学方法评价试验结果.并对空白对照组、试脸组结果进行综合分析评估.经统计学分析试袈组和空白对照祖比较p24孔板：DTntnsweII孔板；m）细胞培养旗：n）ImaReJ图像处理软件.6.2.2 试剂和题材含10%新生胎牛血满DXEM低糖络笄基（含10%FBSDWM低触培养基）.6.2.3 细胞系1114.2.3.6.3剌激物溶液制备115.3.64试验方法按照表3规定将处于对数生长期的细胞按照IX10,个/m1.的细胤密度MiJ21孔板内，如孔加入1m1.3个复孔，24h后将一火声直尺放过尸孔板孔上方，用Im1.枪垂直于孔板和克尺间划道横线,在IOX显微镜F观察.样品If1.的TranSWen孔板中加入0.2InI.的保妒胶依其厚度为1.Omn1.5皿空白对照殂不做处理,分别在每组中加入3个不同浓度的刺激物.IftffiOh,以及培养12h,24