免疫亲和柱-高效液相色谱法测定饲料中的T-2毒素.docx

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1、免疫亲和柱-高效液相色谱荧光检测法测定饲料中的T-2毒素林森，赵志辉*,韩薇(上海市农业科学院农产品顺星:标准与检测技术探环所，上海201403)摘S：建立了免校亲和柱净化-柱前衍生化-裔效液相色谱荧光检测器测定饲料中T-2徐素含量的方法.样品经甲醉-水(体积比80：20)提取,通过免长亲和任(IAC)净化.以用酸蕙(I-AN)为衍生化试剂、4二甲堪氨基哦喔(DMAP)为催化剂进行衍生,G,色诺柱分别，荧光检测器检测，外标法定Iih结果表明：T-2毒素的线性范困为10-200g1.,加标I可收率为76.9-92.1%,相对标准偏差(RSD)小于6%,该方法可用于饲料中T-2毒素的测定。关词：免

2、疫关和柱：柱前衍生化：高效液相色谱：的料：T-2毒索DeterminationofT-2ToxininfeedbyHighPerformance1.iquidChromatographywithF1.uorescenceDetectionafterimmunoaf11nityCo1.umnC1.ean-Up1.INMiao,ZHAOZhi-hui,HanWei(InstituteforAgri-fodStandardsandTestingTechno1.ogy,ShanghaiAcademyofAgricu1.tura1.Scicnccsy,Shanghai201403,China)Abstr

3、act：Amethodhasbeendeve1.opedfor(hedeterminationofT-2(oxininfeedbyhighPerfOrmajKC1.iquidChromattigraphywith11Uorcscenccdetectionafterimmunoafinityco1.umnc1.can-upandpreco1.umndcrivatization.Thedcrivatiztianreactionwasusedcodeve1.opasensitive,“producib1.eandaccuratemethodforthedeterminationofT-2Ioxini

4、nfeed.T-2toxinwasextractedwithmcthano!-watcr(So:20.v/v).purifiedbyimmunoaffinityCo1.UmnScontainingantibodiesspecificforT-2IoXiIbandquantifiedbyreversedPhasehighperfmunce1.iquidchromatographyWiIhf1.uorescencedc(cc1.ionafterderivatizationwith1.-an1.hn.y1.nitri1.e(I-AN)通讯联系人：乜士辉(1970方探讨员,主要从事农产砧检测探讨.E-

5、Dai1.:塔金Ij1.目:1、国双标准饲料中12毒素的罚定免疫条和柱冷化高效液相色谱法不编制说明，项Haa号：20091339T1.69,2、上海市科技兴农五直攻关项目，项目编号K沪农科攻字2009)第67号and4-dmcthy1.aminopyridine(DMAP).ThCresu1.tsshowthe1.inearrangeofcarnitineisIO-2OOg1.therecoveryis76.9-92.1%,RSDisunder6%,Themethodhasbeenapp1.iediothede1.emina1.inofT-2toxininfeedwithsatisfactor

6、yresu1.t.KeywordstImmunoafTinitypreco1.umn1.crivat7ation;highperformance1.iquidchmmatog11hy;feed;T2toxinT-2毒素(T-2Toxin)是种倍半菇烯化合物，学名为4p-1.5-二乙酰氧基-8-(3-甲基丁酰氧基)-3a-竣基-12,13-环氯单端抱珑-9-烯，为白色针状结晶，室温下稳定,交谢过程不易将其破坏：熔点为15。i5r：难溶于水；易溶于极性溶剂。分子式为C24H35.相对分子质量为466.51叫其结构式如图%T-2毒素是单端抱客烯族毒素(IriChOthwXneS)中危害最大的毒素之一

7、，T-2毒素作为一种常见的真菌毒素，在自然界中广泛存在，主要污染小麦、大麦、玉米等粮食作物，人误食污染的谷物后，可引起呕吐、腹泻、发烧等中毒症状“受T-2毒素污染的饲料可引发动物发生食欲不振，精神沉他，唇、口腔黏膜溃疡和坏死，免我功能下降，产蛋率下降，口腔和喙联合部蔡膜坏死、结痂，舌和扁桃体肿大，时致病菌反抗力减弱等症状，严岐危害畜牧业的发展目前，T-2毒素的测定方法主要有陶联免疫法(E1.ISA)、薄层色谱法网(T1.。和液相色谱法(HP1.C)。T1.C方法虽然分析成本较低，但操作过程烦琐，全复性差。E1.ISA法操作简洁，灵敏度富，但具有交叉反应，假阳性率比较高，定量不够精确。目前国家标

8、准中对于饲料的检测仅有薄层色谱法网，此方法检出限较高，时轻、中度污染无法精确检测，不利于行业管理部门对T-2毒索污染的饲料产品进行有效管理，给用户和管理部门带来很大问题，本文建立了免疫案和柱净化-柱前衍生化-高效液相色谱荧光检测器测定饲料中T-2奇素含量的方法，此方法可以精确定信，并且检出限低.1试验部分1.1方法原理用甲醇和水的混合溶液提取试样中的T-2毒素，经免疫亲和柱净化，I-懑脂衍生化后，用高效液相色谱荧光检测器测定，外标法定量。1.2试剂与材料试剂T-2毒素标准品：纯度大于等于98%：甲醇：色谱纯：乙脑：色谱纯：甲苯:色谱纯;4二甲基第基哦度（DMAP）：称取0.0325g4-二甲基

9、氨基嗽嘘，用甲苯溶解并定容至100m1.：1-慈睛：称取0.030g1-慈脑,用甲苯溶解并定容至100m1.。除特别说明，所用试剂均为分析纯。试验用水为超纯水。T-2毒素标准溶液精确称取适量的T2毒素标准品，用乙脑配成浓度为05mg/m1.的标准储备液，-20C冰箱中避光保存。13仪器与设备WaterS2695高效液相色谱系统：配有荧光检测器：超声波提取胧：离心机：3000rmin,涡旋振荡器；氮吹仪：可控温至50C：注射器：空气压缩机。1.4试验方法1.4.1 试样提取精确称取磨碎混匀的试样50g（精确到0.01g）于50Om1.烧杯中，加入100In1.甲醇水（体积比为80：20）混合溶剂

10、，高速均质2min,转入离心管中,于4C下以3000Mnin的速率离心5min,上清液经定量滤纸过灌，移取IO-Om1.iM液于50m1.容量瓶中，加水定容至刻度，混匀，用玻璃纤维滤纸过泄至注液澄清，收集滤液。1.4.2 净化洗脱将免疫亲和柱连接于10m1.玻瑞注射器卜,精幽移取10.0m1.的上述提取液，注入注射罂中。将空气压缩机与注射器连接，调整压力，使溶液以约1滴/s的流速通过免疫亲和柱，直至空气进入亲和柱中。再用IOm1.水淋洗免疫亲和柱,流速约为1滴s2滴s,直至空气进入亲和柱中，弃去全部流出液，抽干小柱。精确加入1.om1.甲解洗脱，流速约为I滴s,收集全部洗脱液下干净的玻璃试管中

11、，于50t卜用械气吹干。1.4.3 衍生化将上述净化后的样品分别加入501.O.325g1.的DMAP和50U1.0.3皿CHj1.AN,在涡旋混合渊上混匀Imin,于50C水浴反应15min,在冰水中冷却IOmin后取出，50C下用氮气吹干，用1.om1.流淌相溶解，待测.2结果与探讨2.1 提取条件优化2.1.1 提取剂的选择由于T-2毒素的极性较高，因此在样品的提取阶段，选择适当极性的提取溶剂对提高回收率非常重要。依据相像相容的原理，T-2毒素是水溶性的，原则上应当采纳极性强或含水的极性溶剂来进行提取，而对于强极性物质的提取通常运用的溶剂为甲醇和乙睛。在饲料样品中添加1.gg的T-2毒素

12、，比较了不同提取溶剂对测定结果的影响，结果见表1.表1不同提取溶剂对窝定结果的影看提取剂（体积比）回收率（%）甲醇CHJoH38.5乙腑CIhCN26.8甲醉-水CHJOH-H?0（8：2）95.0甲醉-水CH3H-H9（2:8）75.9乙脑-水CHaCN-H2O（8：2）56.8乙璃水CHCN-H20（2：8）29.9从表I中可见，乙脑或乙脐与水的混合溶液的I可收率较低，而甲醉-水的回收率可达到75%以上，满足本方法的要求。考虑到回收率和杂质干扰状况，当比例为80+20时效果最好,这主要是由于免我亲和柱中的填料是具有生物活性的抗体，该抗体在乙胞中的生物活性极低（35%），而甲醉中相对要育一些

13、.（15-20%）,同时考虑甲静的潜在毒性相对于乙璃要小一些，试验选择甲静水（体积比为8（）：20）作为样品的提取试剂。2.1.2 提取方式的选择在空白饲料样品中添加1.gg的T2毒素，静置一夜，采纳振荡、超声、浸泡、高速均质方式分别进行提取。回收率见表2。从表中可以看出，除了浸泡外其他几种方法所得到的回收率均令人满足，但是高速均质的方式可以在最短时间内对T-2毒素进行有效提取，较其他方式有明显的优势，因此采纳该方法进行提取。表2提取方式的选界方法/回收率时间2minIOmin3()min浸泡26%29%39%振荡40%76%83%超声42%75%93%均质93%94%93%2.2 免疫亲和柱

14、免疫亲和柱是20世纪90年头在分析领域得到应用的一种新技术。它是以生物技术为基础,采纳单克隆免疫亲和技术研制的系列免疫亲和柱，具有高选择性和抗干扰性，是目前国际上较为常用的检测真菌毒素样品的前处理方法之与其他净化方法(如液-液萃取等)相比.IAC柱以特效性的单克隆抗体免疫技术为分别手段，可以将真菌毒素分别、净化，并且选择性强，净化效果好。试验中选择美国维康(ViCam)公司的T-2TAG1免疫亲和柱净化待测样品，待测组分T-2毒素被维一吸附，可有效消退杂质的干扰。2.3 衍生化条件的选彝2.3.1 衍生试剂和催化剂的选择I-慈睛(1.-anhroy1.nitri1.e,1.-AN)是一种具有荧

15、光特性的试剂，它取代T-2毒素分子中羟基上的一个氢而生.成一种具有很强荧光特性的物质,在荧光检测器下有很灵敏的响应。4-二甲基氨基毗噬(DMAP)作为种催化剂可以使此衍生化顺当进行，并且能获得稳定的T-2毒素衍生物23.2反应条件的选择温度和反应时间对衍生化反应的影响很大。在样品中添加20gkg的T-2毒素.衍生化反应温度分别限制在2680C,间隔1(C:同时每个温度设置反应时间5-30分钟，间隔5分钟，对应的峰面积见表3。从表3可以看出，反应高峰出现在50C反应I5min条件F表3反应度、时间的确定温度*c峥面枳时间min5IO15202530208923131326X41I48O65149233614835231383630309181251368954148344215001521482755135795540100811214039461500375151246314813621361943501263934I5II15I151949915079771402655136893460139204514963211