免疫双向扩散实验.docx

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1、双向InR法一抗JK分析【原理】双向扩散法是指可溶性抗原与相应抗体在琼脂介质中相互扩散而形成肯定类型沉淀线的方法。沉淀线的特征与位置不仅取决于抗原抗体的特异性与相互间浓度比例，而且与其分子大小与扩散速度相关。当抗原抗体存在多种系统时，可呈现多条沉淀线以至交叉反应。【材料】生理盐水1%琼脂管（每管约4m1.）载坡片打孔器与打孔模板微量加样器与塑料吸头抗体与抗原1、2、3、4、5、6。湿盒【方法】1.将已溶化的1务琼脂盐水管放5660C。水浴箱中平衡温度备用C2将载玻片置于水平桌面上,倾注已溶化琼脂3.5-4m1.,使成厚度约1.5mm琼脂板。3 ,凝固后，将打孔模板置于琼脂板下，然后用打孔器打孔

2、，依据不同须要可制成三角型、方阵型或梅花型。本次试验采纳三角型，即每一个三角型的三个孔为一组。（因本次试验所制备的琼脂板均以载玻片为底板故依据其大小只能采纳三角型同时每一琼脂板也只能制成两组。否则,如采纳方阵型或梅花型则因琼脂板边缘琼脂厚度不够而使周边各孔所加抗原或抗体量不足或溢出，如制成三角型三组，因各孔相距过近相互渗透扩散而难于正确判定结果)。4 .用微量加样器加抗体各101.各组所余两孔各按抗原1、2为一组，3、4为二组，5、6为三组,分别各加入IOHI。留意每加一样品均需更换加样器塑料吸头，以防止交叉现象影响试验结果。5 .作好记录,放湿盒中，置37C。温箱，24小时后视察结果。【结果

3、】说明：(1)融合性沉淀强，说明两孔中抗原相同,为同一性反应。(2)两沉淀线独自形成并形成交叉，说明两孔中的抗原完全不同，为非同一性反应。(3)融合性沉淀弧出现支线，或同时有另一条或两条沉淀线，说明两孔中抗原有相同部分又有不同部分，此为部分同一性反应。单向免疫扩散法(Sing1.eradiiimmunodiffusion)正常人群IgG正常值检测【原理】在含有特异抗体的琼脂板中打孔,并在孔中加入定量的抗原.当抗原向四周扩散后与琼脂中抗体相结合，既形成白色沉淀环，其直径或面积与抗原浓度呈正相关。同时用标准抗原或国际参考蛋白制成标准曲线，即可用以定量检洌J未知标本的抗原浓度(mgm1.或IUm1.

4、)o应用这一试验方法可检测正常人群或患者血清中IgG.IgA与IgM的含量与正常值。【材料】1 .示教部分：2%离子琼脂或生理盐水琼脂（内含2%oNaN?）标准马抗人IgG血清（抗体）（北京生物制品探讨所生产）参考蛋白工作标准（北京生物制品探讨所生产）pH7.2PBS坡璃板或载玻片。打孔器（孔径3mm）与打孔模板。微量加样器湿盒（容器内加湿纱布或泡沫塑料）2 .试验部分：已制备好的含有马抗人IgG抗体的1%琼脂板.1:50稀释的单人份待检血清标本。打孔器、模板、微量加样器与湿盒等。【方法】（一）标准曲线的制备：示教1 .依据玻片的大小，以能制做1.-1.5mm厚度的琼脂板的量，分装其172量的

5、2防盐水琼脂。例如，用一般载玻片制做时其或琼脂量为4m1.,在分装2%盐水琼脂时既为2m1.o溶化后置5660C。水浴中平衡温度备用。2 .稀释抗体：将标准抗人IgG抗体按其效价用pH7.2PBS做成1倍稀释。例如，血清效价为1:140,原浓血清既应稀释为1:70。并分装试管.其分装量应与2羔盐水琼脂演相等。3 .制板：将已稀释的抗人IgG抗体于56C。水浴中预热约半分钟，再倾注于已溶化并维持5660C0的2%盐水琼脂管中，用拇指将管口堵紧。翻转试管12次，将抗体与琼脂混合匀称（留意：抗体与琼脂混合时切勿产生气泡），快速倾注于玻片上，待凝固后既制成。4 .打孔：将琼脂板置于模板上，在同始终线上

6、用打孔器打孔5个.孔距IOmmo5 .稀释不同浓度的参考蛋白标准（工作标准）：应依据制品说明进行稀释,例如：工作标准中免疫球蛋白含量,IgG为100单位/m1.,80.4微克/单位,其稀释范围为上10、1:20、1:40、1:80与1:160。6 .加样：将已稀释的不同浓度的工作标准依次用微量加样器每孔加入103（留意：每一稀释度均应更换塑料吸头）。7 .置湿盒中，放37Co温箱，24小时后视察结果。8 .用量角规测量并记录沉淀环直径,然后以沉淀环直径为纵座标，不同单位/m1.为横座标，绘制成标准曲线。在制做标准曲线时，为尽量削成误差，至少应做两份以上标准板。（二）正常人血清中IgG值的测定：1 .将已制备好的抗体琼脂板置打孔模板上，每一琼脂板可打孔4个（孔径3mm,孔距IOmm）。2 ,将单份正常人血清用pH7.2PBS分别作1:50稀释。3 .用微量加样器分别取1:50稀释的单人份血清标本101.加入孔中，每份标本应各加两孔（每份标本均应更换塑料吸头）。4 .作好标记置湿盒中，放37C温箱，24小时后视察结果S）【结果】测量各份标本的沉淀环直径并记录结果，然后用标准曲线测出每份标本所含IgG的单位/m1.,并换算为mgmo将全班试验结果做出统计与均值，并写出较完整的试验报告。