彗星实验要点.docx

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1、“1、凋亡细胞的视察：看过国外此法作出的凋亡细胞彗星图像，很美丽，用CASP软件分析后，其曲线呈典型的双峰，而正常细胞为单峰。我的一些教训：视察凋亡细胞最好把电压、电流、和电泳时间均调低,否则,凋亡细胞中的DNA片断跑的太块,荧光下根本看不到凋亡细胞的尾巴.注:我用的是中性条件，20V,200mA,20min,凋亡细胞视察宜选用IOy100mAJOmin,华友们假如有异议，请不吝赐教，也对我有所梢助。”2、,解旋20分钟应当没问题，但是我认为您的电泳时间过长，当然我不知道您的电泳条件（电压、电流、），我认为20分钟足够了，时间长了一是奢侈时间，二是彗星图像不好，不利于分析。您的裂解时间有点短了

2、，文献报道，最好不要少于1.5小时3、一般100UIO.5%低熔点胶中含400个细胞就足够了4、本版【图片仓库】子版有我做的彗星图像，感爱好可以看看，5、留意，CASP只读.tif扩展名的图像，假如你的相机拍摄的图像可以有.Iif格式，就更好1.假如是jpg格式，那还要在计算机中转换一卜.，不过很简洁，6、首先，荧光染色的东西最好立刻看，否则影响结果。其次，您的染色液量我觉得多了点，我用2ugm1.,Im1.注射器1滴就可以。笫三，要忠于试验结果，图象内容不能更改，可以用ACDSEE或PHOTOSHOP转换图象格式或大小，所以，作出来的试验图象质量要好7、。背景的选择问题，假如图片质量好的话，

3、背景大小不同，对结果影响不是很大，假如图片背景一塌糊涂，那背景框的选择确定对结果产生很大影响。我的建议：背景框不要太大，参考我贴的那个图。留意，背景框可以在细胞的上面或下面，假如背景框在上面时，分析后的图像（分析后出现一个头、尾分明的图像，是基本重合在细胞上的）质量很差，很不规则，那再把背景框调到下面试试，假如还是不好，那只能说你的结果质量不好了。背班框的选择关键在于分析同一批细胞，背班框要相同，才能保持资料的可比性。结果的保存，记得似乎运用说明里提到了，假如没有提到，那就是我原创的！呵呵,先卖个关子。FI1.E菜单下有一个EXPORTRESU1.TS（输出结果）的按钮，点击以后，默认是.TX

4、T文本文件，好了，给你的输出文件起个名字，选择保存位置，点击确定就OK了，回到你保存的输出结果文件，发觉它是一个不行识别的文件,那就干脆把它的扩展名改成TXT,打开它，看看你的结果，包括13个指标，很好，这个.TXT的结果文件可以被SPSS统计软件干脆识别，不是很便利吗？（假如你情愿把数据一个一个地输入统计软件，我也没看法，呵呵这里还有一个小窍门，在用SPSS读取之前，最好把你的结果文件调整一下，这也是我发觉的。把全部的指标都排列到第一行，下面的结果要和指标一一对应，每个数据之间留空格（默认的），行与行之间不要用回车，就是不要有空行，其实调整起来很简洁，主要是调整TXT文本文件阅读框的宽度。调

5、好后，SPSS软件干脆识别，很便利，为你节约很大工作量，不信就试试。，8、我用双层铺胶法，自制微电泳槽，第一层:0.75%正常熔点胶，100g,其次层：0.75%低熔点胶，75U1+25口1淋巴细胞悬液，用枪干脆把凝胶吹到自制的微电泳槽中，铺平即可。其次层以相同的方法铺到第一层上面，不必担忧脱胶的问题。9、盖玻片用一般的就可以了，但是可以自做的，一般的盖玻片其实有点小了，假如胶很多的话，其次层胶特别厚，这样不利于视察细胞,而且不利于电泳。3。染色后要用双蒸水冲洗，据我的阅历，冲要冲的特别干净，否则背景太亮了，拍照后不简洁分析。但是乂不能用劲的冲，否则胶很简洁掉下来。4。电泳的时间一般是20分钟

6、，电压各个细胞是不同的，你可以查查有关资料，自己做做预试验。一般状况下，比照组的细胞的tai1.DNA%应为10%左右，不超过20%,假如尾巴太短了，也不好。5。分析要用荧光显微镜的，详细的染液，有不同的激发波长。CaSP软件在前面的帖子中就有。很好用的，在举荐一次哦。最好用显微镜自带的相机，假如你的技术好的话，可以在目镜照相，洗出来扫描后可以分析的。6.把EB滴加在胶上就可以了。视察时要在暗室里。我是用EB的，电泳后，干脆在胶板上滴上一滴，然后用水冲洗，用滤纸吸去多余水分，荧光显微镜视察10、SCGE技术的原理：细胞核中的DNA为负超螺旋结构，而且很致密，通常DNA双链以组蛋白为核心，回旋而

7、形成核小体。一般状况下，偶然的DM单链断裂对核酸分子双股结构的连续性影响不大，而且不易释放出来，但是，假如用去污剂破坏细胞膜和核膜，用高浓度盐提取组蛋白，DNA残留而形成类核。假如类核中的DNA有断裂，断裂点将引起DNA致密的超螺旋结构松散，在类核外形成一个DNA晕圈。将类核置于电场中电泳，DNA断片可从类核部位向阳极迁移，经荧光染色后，在阳极方向可见形似彗星的特征性图像，故称“彗星试验”。彗星尾部即为迁移出类核的DN片段。此时彗星尾部有可能还与头部以单链或双链的形式相连。DW损伤越严峻，导致DNA超螺旋结构越松散，产生的断裂点越多，DA片段越小，从而在彗星尾部出现的DNA断片越多，则慧尾的长

8、度、面积和荧光强度越大。通过测量彗星尾部的长度、面积或荧光强度等指标，可以对DN的损伤程度进行定量分析。随着SCGE技术的发展，可测量的指标也越来越多，而且更精确。目前，用于SCGE分析的指标主要分为四类，包括形态指标、距离指标、强度指标和矩类指标。其中形态指标有彗星细胞率：距离指标包括甘星尾长、彗星全长、彗星头部半位、尾部半径；强度指标包括头部DNA百分含量、尾部DNA百分含量、头部面积、尾部面积等：矩类指标包括尾短、OIiVC尾矩等。11、HQ是作为阳性比照的吧？它是标准的断裂剂。但是不同的细胞对它的敏感程度是不同的，我觉得前几个数据有必要删掉，30微摩尔以卜的浓度应当是会造成断裂的0.P

9、I染色我见过，染出来的效果也是很不错，是蓝色的。不确定用EB染色呀，毒性乂大。12、单细胞琼脂糖凝胶电泳(cometassay)Sing1.eCe1.1AgaroseGe1.E1.ectrophoresis(SCGE)步骤：一、细胞悬液的制备：1 .吸弃旧培育基，D-HankS冲洗2遍2 .0.25%胰酶消化,待细胞变圆，间隙增大,马上终止消化，用弯头吸管轻轻吹打细胞,使成细胞悬液,加入离心管，100Orpm,离心10min,弃上清，以ImID-HankS悬浮细胞，以上应在暗室与较低温度下进行。各组收集细胞23X106个，必需分散成单个。悬浮于ImIPh7.4PBS中，此步在喑室与较低温度下进

10、行。二、玻片制备：1 .玻片磨砂。2 .制备0.5%正常熔点琼脂糖(NMPA)和0.5%低熔点琼脂糖(1.MPA)各2Oni1.o用pH7.4PBS配制。称0.Ig溶于20m1.PBS,如NMA与玻片附着不紧，可上升其浓度至0.65乐铺第一层胶：0.5%NMPA100U1.于磨砂玻片面，快速盖上盖破片，室温5min使其固化，即为第一层胶；其次层胶:37C0.5%1.MPAK)OHI+30-50UI(I-2x106)细胞悬液(10:1)混匀，快速铺于第一层胶上，盖新盖玻片，移入冰箱5min,使其固化。*余下的细胞100OgX1.Omin离心，于0.1-0.2m1.悬浮缓冲液中混匀,做Wester

11、n-b1.oto三、细胞溶解：1.玻片缓缓浸入簇新配制的冰凉细胞溶解液中，4C1小时或过夜。玻片在细胞消化液中可至少存放4周。细胞溶解液配制NaC1.146.1gNa2EDTA37.2gTrisbase1.2g用约12克NaoH调整PH至100用去离子水定容至890m1.。过泄除菌，为贮备液。室温保存。应用液加入TritonX-100至1%DMSO至10%（消退血液或动物组织中血红蛋白释放的铁产生的F1.由基）应用前冷藏3060分钟。4、碱化处理与电泳：取出玻片，放入水平电泳槽中（正极端），并列放置，不留空隙。倒入微新配制的冰冷电泳缓冲应用液，高于胶2三,无气泡。放置】0、30分钟，本室一般采

12、纳15min,使DNA解链。25V,300m电泳20分钟。通过调整液面来调电压。（电压先调到最大，电流30OmA然后通过液面来调整电压）电泳缓冲应用液：IONNaOH30.0m1.（12克）2OO11IEDT5.Om1.（二钠为0.372g）（附言：电泳缓冲液储备液：IONNaOH200g500m1.水，两周内用。200mMEDTA14.89g200m1.水,PH=IO,室温保存。）定容至100Om1,混匀，电泳前簇新配制。可通过变更液面高度来调整电压。5、中和：切断电源，取出玻片,置染缸，中和缓冲液浸洗,3次X511）in中和缓冲液：Trisbase48.5g去离子水定容至100Om1.用1

13、0NHC1.调整PH至7.5。室温保存。6、染色呈中性后，凉干玻片，501.EB应用液染色，盖上新盖玻片。EB染色液（IOX贮备液）EB1mg去离子水20m1.室温避光保存。临用时将贮备液稀释10倍。使终浓度为5ugm1.以上除中和与染色外，各步均应在暗处进行，以避开额外的DNA损伤。7、镜检与结果评价EB染色后的DNA样品应尽快在荧光显微镜下视察。未受损细胞表现为以圆形荧光核心，即彗星头部，没有尾巴。受损细胞则有彗尾伸向阳极，形成一个亮的头部和尾部。用目镜测微尺或拍摄X400倍照片再作推断。每个样品中至少随机选择25个细胞测定。彗星尾长度35m为未损伤，35-70m为中度损伤，70Um为重度

14、损伤裂解液中，最难溶解的是S1.S,它在中性的时候不易溶于水，所以你把其他的药品加进去后，先不要加S1.S,这里须要磁力搅拌器搅拌，但是时间不会很长。溶解后，用NaoH把PH调到10,这里调PH值要用NaoH固体，然后把S1.S加进去，在用磁力搅拌器搅拌，般须要加热，50度左右就可以了。大约搅拌1个小时就可以溶解。这时，溶液应当是透亮的，不是乳白色的。加热溶解的过程中，可能会损失确定的水分，等搅拌完了后，你要把溶液的量补充到你最终须要的体积。当你从冰箱中取出裂解液后，裂解液假如有沉淀，你就把它放在37度水浴中让它充分溶解,然后把DMSO和TritOnTOo加进去,这时，还是乳白色的，你把他放在

15、37度中放一会就可以了。留意，溶液的颜色是透亮清亮的，浑浊的话，不能起到裂解的效果，最终跑不出彗星来。中性条件跑出来的是D、A的双链，单链断裂不会出来，而强减性条件下，破坏了断裂部位连接碱基的氢键，这样，双链断裂也就成了单链形式，可以说碱性检测的是“双链和单链断裂的综合损伤”，两种电泳条件的最大区分是适用于不同的试验需求。碱性条件的SCGE的建立也是为了满意不同试验须要。实践中要依据DNA致伤因素选择试验条件，如：电高辐射对DNA的损伤以双链断裂为主，应当选择中性SCGE,而且可以解除环境因素对DNA损伤的影响（因为DNA很简洁受到环境因素的影响而断裂一一单链为主），假如用碱性的话，就不能区分

16、哪些是试验因素引起的断裂，哪些是其它影响因素引起的断裂。假如试验致伤因素是以DNA单链为主，那就应当选择碱性SCGE了。有一点须要说明一下，碱性SCGE的确增加了检测的敏感性（中性SCGE达不到），但牺牲了特异性，DNA很简洁受很多因素的影响而产生断裂，如吸烟、饮酒等不良生活习惯、环境污染等因素。所以碱性条件很难从试验结果中剔除哪些也非试验致伤因素造成的，对试验结果会或多或少有点影响。所以说SCGE条件的选择主要还要依据试验的须要来定。我在下面这个帖子里说的“碱性SCGE在大剂量照耀时的各项指标简洁形成平台”这句话是相对中性SCGE而言的，因为碱性SCGE的检测敏感范围要比中性SCGE的敏感范围低，即碱性在小剂