ELISA检测.docx

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1、E1.ISA检测一-固相捕获法测IgM抗体在病原侬急性感ft的诊断中，通材需桧测IgM抗体，如急性甲理肝炎诊惭的血清抗HAVIgM桧测.颊性乙硼炎病毒腐0的血清抗HBcIgM检测和TORCH项目的系列I9M检测等.IgM抗体也石使用间按法测定的，如目前在市场上可见到的有些TORCH系列的IgM检测试剂盒.在使用间接S!IgM抗体时,由于血床血清样本中含有高浓度的IgG抗体,其中SJ分符异IgG抗体将与IgM抗体竞争与固相抗原结合,从而干扰IgM抗体的检测.因此,在使用间接法测定IgM抗体时，通瞒将血清样本用杭人IgG抗体或SPA预处理,以去照IgG的干扰.这样不但测定较为警琐,而且影对S!定的

2、特异性和灵8M5.目前，常用的IgM抗体检冽方法为撕法，即以阮人IgM抗体新人UtS）作为同相抗体，当加入心湾标楠，具中的IgM美抗南特异的和非特异的）国可被固相抗体网联,再加入特异抗（R.其与固相上漏映的IgM抗体结合后，加入第标抗特异抗原的抗体，最后S1.1.入底物显色.具体操作步物口下：1 .首先将抗人IgMbt链抗体于嫉酸部缓冲法中40c下过夜包褴莪基乙熔等固相,形成固相抗体.洗砂去除未与3!相结合或结合不堪的抗体后,用小牛血清或牛血清白馔白等封闭，洗澎去除未结合的郃分及永思.2 .加入含待测IgM抗体的临床”本如血清等，沮育一定时间后洗板；此时,特测林本中的JgM抗体就会与回相上的抗

3、P梃抗体反应而IR对于回相上.3 .JQ入特异的抗原如HAV抗风HBcAg等,混音一定时问后洗板：ItW.特异抗原就会与固相上的特身IgM抗体发生反应.4加入SB标记的杭特异抗原的抗依,温声一定时间后洗板，此时,在固相上即膨成相应的杭原抗体发合物.5 .加入第鹿IS.湿白显色观定本方法受事但建的是RF（IgM类）及其忸E特异IgM的干扰，RF（1.gM类）由于其微与固相抗人U链抗体结合,并可与SS后SO入的6标抗体（动物IgG）反应，从而导致俯阳性反65.而非椅异】gM由于其在第一步温育中，可与转身IgM克令与固相抗体结合,所以会影响测定的灵敏度.因此，使用本法测IgM,必须对临床格本进行适当

4、稀释.样本椽释石,上述产生干扰作用的非特片IgM含量值少,而特异IgM由于处于相应病原体的急性源壮圉,淘度很高.一定醍译后，不会有明显影响.况且,在某些病原侬如HBV的慢性感蜩段,IgM类特斤抗体也胞持续存在.只不过满度要低很多.因此，如不对血清样本稀释,就直接检测，即使品没有亚特异IgM的干扰,阳性测定结果也没有急性M染的诊断价伯.现在.有些成剂生产厂家,为了迎合临床实验空减轻劳动强度、筒便操作的受求，生产了不需对样本进行斶集的抗HAV1.gM和抗,HBdgMEUSA试剂食，现有不少实验室也在使用.避于上面提9!的原因，我IiiaW施床实验室在做抗HAV1.gMIff1.aHBcIgM等类啦

5、J1.B1.应使用对样本进行稀性的试剂金,以保证检测的临床价假.酹联免疫吸附测定E1.ISA结果判定的常用缩写EUSA测定按其式示测定t三宋的方式分为定性和定测定两大类.定性测定只是对根本中是否含有待iW3曲三出育或允凌6.糊用IStr和W粗豕可见定性测定通常是用于传爱性痛原体的抗原或抗体的测定，以判斯特定病原达旃染的存在与否.而定量测定期息对标本中待测沆原的多少进行值测定，以日体敢0表示.定测定2S本上是用于蓑病尿体抗晾物质的测定,如激索.细胞因子.舲痛标芯物.小分子为期等.目前国内应用的EUSA试剂盒绝大郃分是用于传发性病原体的班晾或抗体的定性测定,也有少部分用于.FP.hCG.SM烟射例

6、S*a定EUSA钿版的舱和阳性.修员依Iga蝴J渊淀的IBtIy蛇伯（CUt-Off）.定量史定的1”依据是试剂金中所带标准病同时测定得出的笊及反应曲域又将:标准西域）.实物室进行室内质的使用.下面再解程一下在EUSA定性测定i三果列定中JS用的一些够写:（I）S/C0:其中S为SamPJe（样本）或SPeqmen（标本就前与，去示的越琬!定的CK光阂B,CO为cut-off值的简片.除克安丽法外,其他EUSA定性测定模式中，当S/C。值大于或等于1时，标本的测定为阳性，小于1时为阴性.S/N或P/N:其中SH（I）.N为negatve（闪性对脚的简耳,P为Patient便？5）的简写.姣乐的

7、试剂盒很多都使用S/NPN2.1为阳性判定标准,现仍有一些试制盒使用这种方式.这冲方11SCO方或无根本性区别，只不过是前吉将性时照（N）的2.1倍机为cut-off值而已.酶免疫试验的优点及局限性而免疫试验之所以能成为崎乐免疫检验中的主导技术,是与它的方法上的特异性和灵敏性、淡作上的简便性以及位剂的物定住分不开的,还有很IB要的一点是，其对环境没存污染减胁.尽管如此，作为一项免疫检验技木.酹免疫试验还是有具月限性的,不但所珍测的生物学体液样本如Jiiai中有可能存在各种干扰实验的因素,而且在实检过程中，影哨结果的因素也很妥,尤其是迸行手工的E1.1.SA测定时.It外,在定性EUSA碘中,1

8、8性列定伯（CUT-OFF）的建立，是在一定的统计学视上的，相对于S5个具体的受险者来说,具有可能并不具备正确性.例如,使用EUSA方法检测抗HCV及抗HIV或HBsAg,有时慢,检刑所得的槌结也许并不是真正的阳性,而需要使用具妫方法如近组免疫印边（recombinantimmurobotas-say,RIBA）.Hi白aHWeSternb1.t,WB）aa33mi,报告阳性.这里抗HCV和抗H1.V的恰测均使用病毒部分的三t因工用抗黑,耳他一芸病击如流感病毒.饵照炎病期和水位病毒等JB染人体Jg,亦或一些自身抗体，也有可墟会导致假Ia性反应.HBsAg的测定主要是弱汨性的叵翅,这与E1.1.

9、SA3U定的,茨区有关系,处于cut-off伯冏国亦即灰区”的t三果的可霞性通常姣差,阳性当然需要增认,用性却也未必是真,这一点在血站筛检献血员血液时是等常H要的,必须引起注意,并采取适当的搭地,昉止此类产血即明人们般/的传条性疾病坦IfiUHSff1.，本书后面的有关承汪会对此何通做详烟论述.ft5t,免疫测定的基碇是抗摩抗体的特异反应，因此，KI检测抗原，娘了要求抗体（单抗或色抗）足特片的9卜，还姿求待测抗原上必负存在有能与所用抗达结合的抗原决定篌,如果因为IS因突变导致某些位点的不安达,或者结合位点因为某些原因被封闭或眼断,都会影响抗体与抗原的结合,造成假阴性结果.如桧测抗侬,则要求所用

10、包被抗原应尽可能包含所有的结鼠抗原决定垓,同时又尽可能不含有非特异的成分，这一点往往由于技术水平的Ig制而雉以完全做1.因此，从某种雳义上来说，假阳性钝明性是不娓完全i免的,尽管通过努力,可以将耳碍至很低的K度,这也是津立临床免疫情5方法所努力的方向.酶联免疫吸附测定操作要点1标本的采取和保存可用作EuSA测定的标本十分广泛,体液（如血清）.分泌物（呻液）和辟；!?糊（如尿液.箕使）等均可作标本以测定国中某种抗体或抗原成份.有些标本可育芨迸行测定（如血清.屎液），ww霖经预处理（如JS便和某些分诊软）.大部分E1.1.SA检测均以血清为标本.血浆中除尚含有纤堆蛋白原和抗凝剂外，其他成份均同等于

11、血清.制备血浆场本需18助于抗茶剂，而血清标本只受持JIi酒自然朦包、血块收姐后即可取得.除晒情况外，在医学校验中均以H1.滑作为检测标本.在EUsA中Iii旅和山清可同等应用.血清标本可技常规方法采荣,应注费避免溶血,红细胞溶解时会林放出具有过氧化物演活性的曲质,以HRP为标记的E1.1.SA测定中,溶J1.1.标本可能会审加非特用性M色.血清标本宜除鲜时检观.如有细的污Jft,Jfi体中可榜含有内源性HRP.也会产生低阳性反应.如在泳箱中保存过久,具中的可发生K合.在间接法E1.1.SA中可使本底加深.一般说来,在5天内测定的m湾标本可放（于4c,超过一阊测定的需低温冰存.苏结m清电解后，

12、暖白质均郃浓缩,分布不均，应充分混匀宜注爆.送免气泡,可上下I1.f倒混和,不荽在泯匀器上强烈髭38.混卷或有沉淀的皮酒标本应先SB心或过送.渡清后再检9J.反复东除会使抗体效价跌落,所以3J抗体的血清标本如霹保存作多次校测,宜少量分装添存.保存血清门采建时就应注患无药漫作，也可加入适当防焉剂.2试剂的准笛按试剂盒说明书的姿求准组实验中需用的试剂.E1.1.SA中用的蒸!S水或去离子水，包括用于洗涕的，应为新鲜的和高质的.自SS的燃冲液应用PH计测校正.从泳箱中取出的试验用试剂应待i三度与室温平衡后使用.试剂盒中本次试验不需用的部分应及时颇海箱保存.3加样在EUSA中TK有3次加W步聚，即加标

13、本，结合物，加底J.加W时JS将所加胡加在IEtSA板孔的底部,避免加在孔壁上部,并注息不可泻出,不可产生气泡.加标本一股用循量加样JS,按规定的加入板孔中.每次加标本位更接吸聘,以免发生交叉污尖,也可用一次性的定量28料管加样.有此测定（如同发法EuSA）需用桶烽的Ui清，可在试隹中按现定的稀释度稀释石再加样.也可在坂孔中加入照春液，再在其中In入血清蜥本，然后在微型意建浮上H建1分钟以保证泡和.加曲结合布应用JS和底初应用液时可用定多Iam液羽.使加液过程迅速完位.4保温在E1.1.SA中一般有沏次抗原抗内反应，即加标本和SCeJ结合翁后.抗原抗体反JS的完成需要有一定的温度和时间，这一枳

14、源过程称为温育（incubation）,有人称之为簿中,在EUSA中似不恰当.E1.1.SA厘固相兔5测定，抗原.抗体的结合只在固也表面上发生.以抗体包根的夹心法为例，加入板孔中的标本，其中的抗感并不是都有均等的和团相抗t2合的机会，只有最贴近孔壁的一层溶液中的抗原苴接与抗体接触.这是一个逐步平衡的过程，因此需经扩脓才筋达到反应的终点.在具后加入的88标记抗俵与固相抗余的结合也同样K1.比.这就是为什么E1.1.SA反应矽JB需要一定时间的混U.退之常采用的温度有43C.37X.交温14C（泳箱温度）等.37PJB实验室中常用的保温if1.度，也是大多数优（R抗体t三合的合适退度.在建立EUS

15、A方法作反应动力学研究时,文检哀明，两次抗原抗体反应一般在37式经1.2小时,产物的生成可达顶修.为SO速反应,可提高反应的温度,有些试验在43t迸行，但不同来用更商的涉度.杭勒抗体反应4P更为彻底,在放射免疫测定中多使反应在冰箱中过夜,以形成最多的沉淀.也因所需时间太长,在E1.EA中一股不予采用.保温的方式序有的EUSA仪器网有符制的电热焕外,一般均采用水浴,可将EUSA板置于水浴箱中，E1.1.SA痴蛔贴餐水面，使温度迅速平衡.为避免然发，sisi11as,也可用徵科贴封纸或供暂睽!8篮板孔，此时可让反应权尊浮在水面上.先用保阻箱，EUSA板应放在湿盒内.湿食要选用传热性良好的材料如金属

16、等,在盆底翊的炒布,最后将E1.1.SA板放在湿沙布上.湿盘应先放在保温箱中预温至规定的i三度,特别是在气遢竣低的时候更应如此.无论是水浴还是湿食温可,反应板均不宜鼓放,以保证各板的温度都能迅谦平衡.室温温育的反应,操作时的室温应严格聚制在坝定的JS国内，标准左遢沮度是指20-25C,但日体授作时可根据说加书的姿求控制阻亡.室温阻口时，EUSA瓶只姿平置于操作台上M可.应注JIRiaSJ的逼度1时间应麒定力求准的.为保证这一点,一个人娓作时，一次不宜多于两块板同时观定.5洗涿洗滋在EUSA过程中虽不是一个反应步覆,但却也决定着实油的成败.E1.S1.A就是靠洗添来达到分离游离的和结合的S1.标记软的目的.通过洗涿以清嫁残用在短孔中没能与因怛抗原或抗依结合的物S.以及在反应过程中非聃异性地双IH于国相St体的干抗物质