苍术内生菌对苍术有效成分的影响.docx

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1、苍术内生菌对苍术有效成分的影响摘要目的：从苍术中分离内生真菌，筛选能专一性转化苍术有效成分的菌株，实现内生真菌对茅苍术有效成分的转化作用。方法:利用微生物体外转化方法，通过气相色谱追踪挥发油变化，筛选出能专一性转化挥发油的内生真菌。通过单因素试验研究碳源、转速、装液量、初始PH和植物组织添加对内生真菌转化的影响。并选取对转化影响较大的因素进行正交试验。结果：结论：关键词苍术：内生真菌：次生代谢产物；专一性转化1 内生菌的分离和鉴定1.1 材料与方法1.1.1 材料1.1.1.1苍术新鲜植株(来源)1.1.1.2分离用培养基PDA培养基1.1.2方法1.1.2.1内生菌的分离：参照Strobe1

2、.(1996)Schu1.thess&FaeIh(1998)的方原植物根、茎段、鲜嫩叶片经自来水冲洗3次后,在超净台上用70%酒精消毒1min,0.1%的升汞消毒10min,无菌水冲洗多次,叶片剪成O5Cm0.5cm的大小,根和茎每段0.5cm长,置于PDA培养基上27C培养，待截断处菌丝长出，切取菌丝转入另一含PDA培养基的培养皿内，27C恒温培养,之后转接到PDA培养基或含茅苍术组织浸汁的PDA培养基上观察培养性状,待菌丝长满皿后，根据生长及培养性状，部分需放入4C冰箱中诱导产胞，4-6个月观察产泡结构。鉴定参照巴尼特等（1977）和魏景超（1979）的方法。1.1.2.2真菌鉴定培养基以

3、及使用方法衣2.1培乔基Tab1.e2.1Cu1.turemedium孟加拉红琼脂培养基KH2PO4IOg.MgSdH2O0.5g.WjiaWi10.0g,孟加拉红0.033g,蛋白陈5.0琼脂20g蒸慵水100OmIPH6.8马铃薯葡他俯琼脂培养基水球布培养基（TWA）SMA培养基3铃*200g,偷轮糊18g.琼脂18g,蒸饲水100OmI作氏琼脂培养越（CA）作氏酢母琼脂培养基（CYA）麦芽:汉汁琼脂培养基（MEA）SNA琼-15g,蒸福水100Om1.DCXtrOSC1.Og.Asparagmc2g.K1.1.PC40.5g,MgSO471.bO0.25g.Thianiincch1.or

4、ide0.5ng.Agar15g.disti1.1.edwa1.er1000n1.NaNO33.0g.MgSO47HrO0.5g.K2HPO41.0g,FcSO47H2O0.01g.KC1.0.5g.Agar15g.Sucrose30g.disti1.1.edwater100OmINaNO33.0g.MgSO47HQ0.5g.K7HPO410g.FcSO*7H：O0.01g.KC1.0.5g.Agar15g.Ycast5g.Sucrose30g.disti1.1.edwater100OinI麦芽提取物20g,去臼陈1.g,醉母#5g,t20g,琼脂15g,蒸馆水100Om1.燕麦片琼脂培养基（

5、OA）KH2PO41.Og.KNO31.0g,MgSO47H3O0.5g.KC1.0.5g,前狷糖0.2g.0.2g.琼腼20g燕麦片20g.琮脂18g,蒸悔水100Om1.1.1.2.3培养方法：首先用孟加拉红培养基进行真菌的分离，后将分离得到的真菌菌株转接到标准培养基上培养，将PeniCi1.1.iUm（青霉属）和ASPergi1.1.US（曲霉属）转移到CA、CYAMEA培养基上;将MUCor（毛霉属）转移到SMA培养基上：将Fusarium（镰刀菌）转移到SNA培养基上：其他真菌均转接到PDA培养基上，25。C光暗交替条件下恒温培养。1.1.2.4真菌鉴定：对分离纯化的真菌菌株在宜径9

6、cm的相应平板培养基上培养612d,在显微镜下观察产抱结构、菌丝、泡子形态及大小，并参照菌落颜色、质地及形态大小等特征后，根据相关真菌分类资料68-73(王拱辰等1996;齐祖同等2003：贺运春等2008；郑儒永等郑儒永1998：Brayford1987),对各真菌菌株进行形态学鉴定，确定真菌种类及分类地位1.2统计分析选取茅苍术不同部位的组织块各200个，进行内生真菌的分离、鉴定和统计分析，并按照以下方法计算分离率和分离频率6。分离率(ISo1.ationRate,IR):是指某一类型内生真菌菌株数占分离样品总数的百分比。分离频率(ISo1.ationFrequency,IF):是指某一类

7、型内生真菌的菌株数占分离得到的总内生真菌菌株数的百分率，用来判断该类型真菌是否为植物内生真菌的优势菌群1. 3结果与分析1.3. 1苍术内生菌的种群构成从茅苍术植株中分离获得内生真菌96株，经菌落形态、显微形态观察，鉴定为纲，目，科，属。茅苍术内生真菌的种群组成在属的分类水平上屈为优势种群，分别占总菌株数的%(表1)。表1苍术内生真菌的群落组成纲目科I1.菌株数一W2内生真菌对苍术影响的初步探究2.1 材料和方法2.1.1 材料苍术内生真菌PDA培养基2.1.2 试剂和仪器环己烷（分析纯）正十五醇-硝基奈内标旋转蒸发仪恒温霉菌培养箱HPSF-1890气相色谱仪及氢火焰检测器FID2. 1.2方

8、法采用有机溶剂萃取法，将苍木根（叶）粉碎，称取100g的粉末，加入4倍体积环己烷浸泡8h,超声破碎30min,5000rmin-1离心15min将萃取液经无水硫酸钠干燥，过滤，无水低温蒸储挥去滤液中环己烷，得苍术挥发油，红棕色油状液体，具有特殊浓郁香味2.3. 内生菌对苍术挥发油各种成分含量的影响采用温室盆栽方法，设接种和不接种2个处理，不接种菌根真菌的处理编号CK,接种菌根真菌处理的编号VA,每处理3个重复。将陶盆和土壤分别在105C高温下灭菌2h。花盆直径为13cm,装土1kg。每盆加接种剂50g,对照盆加等量灭过菌的接种剂，同时给对照盆各加20m1.浸泡接种剂（30g）的滤液，以保证与除菌根菌外的其他微生物一致菌株对挥发油各组分的降解将活化的菌株接入以挥发油为唯一碳源的查氏培养基中28,200r-minI培养，每隔4d取样，将培养液离心获得上清液用环己烷将挥发油萃取，沉淀冷冻干燥后用等量环己烷萃取，旋转蒸发浓缩至2001.,添加一定浓度的正十五醇-硝基蔡为内标，分别精密吸取11.,注入气相色谱仪测定每组重复3次，以不接菌组为对照，测定不同组分的含量变化a内生菌对在术生长的影响为了探讨本研究分离到的株内生菌是否对茅苍术生长有促进作用，将这些菌株分别接入茅苍术快繁苗。b、内生菌对苍术抗病性的影响