吸附百日咳菌苗、白喉类毒素混合制剂制造及检定规程吸附百日咳菌苗、白喉、破伤风类毒素混合制剂制造及检定规程.docx

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1、吸附百日咳菌苗、白喉、破伤风类毒素混合制剂制造及检定规程本品系由百日咳菌苗原液、精制白喉类毒素及精制破伤风类毒素用氢氧化铝吸附制成。供儿童预防百日咳、白喉及破伤风之用。1抗原要求1.1 百日咳菌苗原液应符合附录1百日咳菌苗原液制造及检定要求中2.4项的规定。1.2 精制白喉类毒素应符合吸附精制白喉类毒素制造及检定规程中4项的要求。1.3 精制破伤风类毒素应符合吸附精制破伤风类毒素制造及检定规程中4项的要求。2制造2.1 配方每m1.制剂中各种抗原成份含量如下：百日咳菌45亿90亿精制白喉类毒素201.f精制破伤风类毒素51.f2.2 吸附剂配制，见吸附精制破伤风类毒素制造及检定规程5项。2.3

2、 氢氧化铝稀释以蒸储水按吸附后之总量将氢氧化铝原液稀释成1.O1.5mg/m1.o硫柳汞含量不超过0.01%(g/m1.),氯化钠含量补足至0.85%(g/m1.),高压蒸汽灭菌。2.4 吸附按计算量将精制白喉类毒素、精制破伤风类素及百日咳菌苗原液加入稀释好的吸附剂内。调节PH至5.87.2。2.5 分批同批吸附剂同批配合的原液同次吸附的制品为1批。如用大罐吸附时，所用抗原和吸附剂可以多批混合(精制类毒素不超过3批)，每罐为1批。3成品检定3.1 物理化学检查3.1.1 振摇后应呈均匀乳白色混悬液。不应有摇不散的凝块或异物。3.1.2 pH值应为5.87.2o3.1.3 氯化钠含量为0.75%

3、0.9%(g/m1.)o3.1.4 硫柳汞含量为1.0%05%(mgm1.)o3.1.5 硫柳汞含量不超过0.01%(g/m1.)o3.2 鉴别试验抽取样品，另枸椽酸钠或用其他适宜方法将吸附剂溶解后，离心沉淀百H咳菌体和残留的吸附剂，按吸附精制白喉类毒素制造及检定规程中7.6项、吸附精制破伤风类毒素制造及检定规程中7.6项和附录1百日咳菌苗原液制造及检定要求中243项进行鉴别试验。3.3 无菌试验按生物制品无菌试验规程进行。3.4 毒性试验应符合附录1百日咳菌苗原液制造及检定要求中245项的规定。3.5 安全试验3.5.1 小白鼠法用体重1820g之健康小白鼠5只，每只皮下注射检品0.5m1.

4、观察7日，不得有局部脓肿或死亡。3.5.2 豚鼠法用体得30040Og豚鼠，每批制品不少于4只，每只皮下注射2.5m1.,分两侧，每侧1.25m1.,应符合吸附精制白喉类毒素制造及检定规程中4.4项及吸附精制破伤风类毒素制造及检定规程中4.5项要求。3.6 效力试验3.6.1 百日咳菌苗免疫力试验每3批抽1批进行,应符合附录1百日咳菌苗原液制造及检定要求中1.2.5项的规定。3.6.2 白喉及破伤风类毒素的效力试验每更换1批类毒素时进行。取体重300400g豚鼠4只，每只皮下注射0.5m1.,第30天采血，将分离的血清等量混合，进行白喉及破伤风抗毒素单位测定。3.6.2.1 白喉抗毒素单位测定

5、用1.r/300家兔皮内法，要求每m1.血清达到0.25IU。3.6.2.2 破伤风抗毒素单位测定用1.+/100小白鼠皮下法，要求每m1.血清达到0.5IUo3.6.2.3 白喉类毒素的效力试验亦可采用攻毒法。取体重300350g豚鼠5只以上，每只皮下注射05m1.第30天各皮下攻击白喉毒素200个M1.D,观察7天，豚鼠死亡不得超过20%；同时另取体重240270g豚鼠3只，各皮下注射1个M1.D毒素作为对照，2只对照豚鼠应发病并于96小时内死亡，允许另1只较晚死亡或发病。3.6.2.4 亦可按WHo推荐的效力检定方法(见吸附精制白喉类毒素制造及检定规程附录和吸附精制破伤风类毒素制造及检定

6、规程附录)。4保存与效期应保存于28。自吸附之日起效期为1年半。附录1百日咳菌苗原液制造及检定要求本品系用百日咳第I相菌种经培育后取菌体制成悬液，加适当杀菌剂，以磷酸盐缓冲生理盐水稀释制成，每m1.含菌45亿90亿。用于制备百日咳菌苗、白喉、破伤风类毒素混合制剂。1菌种1.1 制造百日咳菌苗之菌种、检定用的I相诊断血清、百日咳分型血清及百日咳参考菌苗，由中国药品生物制品检定所分发或经同意。1.2 菌种检定1.2.1 培养特性于包姜(BOrdet-GengOU)氏或其他适宜的培养基上培育，各菌株应具有典型的形态及生化特性。1.2.2 血清学特性将3537C培育40-48小时的菌苔，混悬于生理盐水

7、或磷酸盐缓冲生理盐水内，使每m1.含菌20亿个，与I相血清做定量凝集反应，凝集效价应达到血清原效价之半。同时与单价分型血清做定量凝集反应，其型别应与该菌种标定型别相同。1.2.3 皮肤坏死试验用健康家兔或豚鼠至少2只，用培育4048小时的菌苔混悬于磷酸盐缓冲生理盐水内，然后稀释为几个不同浓度的菌液，分别用每一稀释度的菌液注射于家兔或豚鼠的皮内0.1m1.,经72小时观察反应。如2只家兔或豚鼠中有1只注射0.4亿个菌以下的菌液部位出现出血性坏死者为阳性反应，判为合格。1.2.4 毒力试验用体重1618g之小白鼠至少3组，每组至少10只，在麻醉状态下从鼻腔滴入经培育4048小时，以磷酸盐缓冲生理盐

8、水稀释的菌液0.05m1.观察14天，记录小白鼠生死情况，按ReedMuench法计算1.D50,1.D50菌数不超过1.2亿判为合格。1.2.5 免疫力试验1.2.5.1 方法按附录2百日咳菌苗原液免疫力试验方法进行。1.2.5.2 判定试验菌液每个接种剂量的免疫效价应不少于4.0IUo若试验菌液的效价低于此要求时，可复试，其结果的几何平均值（如用概率分析法时，应用加权几何平均值）4.0IU,仍判为合格。1.3 菌种保存1.3.1 菌种应用冻干法保存。1.3.2 冻干菌种应保存在28Co冻干后抽样按1.2项进行检查，合格的菌种可使用2年，以后每年检查1次，如仍合格可继续使用1年。2.制造2.

9、1 制造百日咳菌苗原液至少应选用2个菌株，制成的菌苗应含1、2、3型因子。2.2 制造百日咳菌苗原液用活性炭半综合培养基或其他适宜的培养基。如用液体培养基，不得含有已知引起人体毒性或变态反应的成分。2.3 原液制造2.3.1 菌种冻干菌种启开后接种于改良包-姜氏或活性炭半综合培养基或其他适宜的培养基上。于3537C培育不超过72小时，以后各代不超过48小时，传代菌种保存不得超过14天，冻干菌种启开后用于生产时不应超过10代。2.3.2 培育可用固体法或液体法培育。培育时间不得超过48小时，经检查为纯菌后，用适当方法收集菌体，混悬于PH值为7.074的磷酸盐缓冲生理盐水中。2.3.3 杀菌原液可

10、用不超过01.%（m1./m1.）甲醛溶液杀菌，放372-3天。亦可用其他适宜的杀菌剂和杀菌方法杀菌。2.3.4 纯菌试验原液应逐瓶（罐）抽样接种普通琼脂斜面及普通血液琼脂斜面（或活性炭半综合培养基）各1管，放3537C培育2天，然后放2426C1天。有杂菌生长者应废弃。2.3.5 原液合并固体法工艺生产经纯菌试验合格的原液应进行合并。不同菌株不同日期制造2的原液应分别合并。合并后，可加适量防腐剂，并保存于28。2.4 原液检定2.4.1 浓度测定每瓶原液应按中国细菌浊度标准与质量检定部门会同测定浓度。稀释菌苗时即按此浓度计算。2.4.2 镜检每瓶原液取样稀释至成品浓度，涂片染色镜检，应为革兰

11、氏阴性球杆菌。至少观察10个视野，应无杂菌。2.4.3 凝集反应每瓶原液按122项与I相血清做定量凝集试验，其凝集效价应达血清原效价之半，如仅达到或低于血清原效价1/4时，应作免疫力试验，合格后方可使用；同时应用单价分型血清做定性凝集试验，其所含型别应与制造原液的菌种型别相同。2.4.4 无菌试验每瓶原液除按生物制品无菌试验规程进行无菌试验外，并做特异无菌试验。如特异无菌试验有百日咳菌生长，可复试一次，若仍有百日咳菌生长，原液应判为不合格。2.4.5 毒性试验2.4.5.1 方法按附录3百日咳菌苗原液毒性试验方法进行。2.4.5.2 判定试验组小白鼠注射后72小时的总体重不少于注射前总体重，第

12、7天小白鼠增加的体重不少于对照组增加体重的60%,并不得有死亡，该批原液毒性试验判为合格。试验结果达不到上述要求，可复试一次。仍达到不过要求，可将原液放置1.2.5项方法及要求进行。2.5 原液保存应保存于28。原液自采集之日起至成品发出不得少于4个月。原液自采集之日起效期为3年。附录2百日咳菌苗原液免疫力试验方法1免疫1.1 动物选用体重1012g同性或雌雄性各半的健康NIH小白鼠。将动物随机分为三组，每组16只或20只(同性或雌雄性各半，为保证攻击后有16只或20只小白鼠，可适当多免疫几只小白鼠)，同时饲养健康小白鼠55只，备做对照用。1.2 免疫原稀释将百日咳原液用生理盐水或pH7.30

13、.1磷酸盐缓冲生理盐水稀释至成品菌苗浓度的1/2,然后再稀释7.5X、37.5X、187.5X,百日咳参考菌苗稀释至每m1.含8IU,然后再稀释成每m1.含1.OIU(0.125m1.)、0.2IU(0.025m1.)及0.04IU(0.005m1.)-1.3 免疫方法将不同稀释度的免疫原分别免疫小白鼠，每只小白鼠各腹腔注射0.5m1.2攻击菌及攻击菌液的制备2.1 菌种小白鼠脑内攻击用58030（18323）菌株。2.2 培养基可用包-姜氏培养基（含羊血20%30%）或其他适宜的培养基。2.3 培养温度及时间放3537C培育，第一代不超过72小时，攻击时菌种的培育时间为2024小时。原代菌种

14、放28可保存2周。2.4 攻击菌液的制备将培育2024小时的菌苔经肉眼检查为纯菌后,刮入生理盐水或pH7.30.1缓冲生理盐水，用灭菌脱脂棉过滤，测定浓度，然后用pH7.07.2水解酷素、蛋白陈水或肉汤稀释成每003m1.含菌8万，作为试验组的攻击菌液，然后再连续稀释，使每003m1.分别含8000、800、80及8个菌，以上5个不同稀释度的菌液，作为对照组的攻击菌液。2.5 工作起止时间自攻击菌液制备（开始刮菌）至注射完最后1只小白鼠不得超过2.5小时。2.6 活菌计数在攻击前后，可将003m1.含8个菌的攻击菌液，接种于包一姜氏培养基或其他适宜的培养基平皿中，每个平皿0.2m1.,每次不得

15、少于2个平皿，其菌落形成单位约为浊度测定的1/4o3攻击动物免疫后14天,每只小白鼠脑内攻击0.03m1.菌液（含8万个菌）,用0.25m1.注射器，4号针头。在试验组攻击后再进行对照组毒力测定，对照组每稀释度攻击10只小白鼠。4记录结果动物攻击后观察14天。攻击后第2天，将试验组动物处理成每组16只或20只。以后逐日观察动物并记录死亡数，最初3天死亡的动物不作统计，至第14天有麻痹、头部肿胀、弓背及明显耸毛的动物按死亡计算。5结果计算5.1 按WiISOn-WOrCeSter氏法计算参考菌苗及待检菌苗的ED5oSD%,每个ED50标准差的范围一般应为64%156%o5.2 按Reed-Muench氏法计算对照组1.D50,1个1.D50的菌数应不高于800个菌。5.3 计算均质性因子“”。5.41 U计算待检原液每m1.应含IU=参考菌苗ED5待检原液ED50参考菌苗每m1.的IU数6效力评价百日咳原液按成品菌苗尝试稀释后，每个接种剂量的免疫效价应不少