小花棘豆中毒对和田羊内脏器官α―甘露糖苷酶的影响.docx

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1、小花棘豆中毒对和田羊内脏器官a一甘露糖昔酶的影响.doc小花棘豆中毒对和田羊内脏器官一甘露糖甘豳的影响摘要：探讨小花棘豆(Oxytropisg1.abraDC)中毒对和田羊内脏器官一甘露糖甘酪(AMA)的影响，进一步揭示小花棘豆的毒性作用机理。将12只和田羊随机分为3组，即比照组、试验I组和试验H组。试验组分别按IOgZkg和20gkg的剂量饲喂小花棘豆.，饲喂至出现典型中毒症状。屠宰后每组随机采集试验羊的肝脏、肾脏、脾脏、心脏和肺脏，检测和田羊内脏器官AMA活性及表达的变更。结果表明，和旧羊肝脏、肾脏、脾脏、心脏和肺脏中高尔基体-甘露糖甘酪11(AMA1.)和溶酶体-甘露糖昔酶(MA2)均有

2、表达。试验I组和田羊各器官的AMA2的表达均与比照组差异不显著(P0.05),试验II组和田羊肝脏和肾脏AMA2的表达显著低于比照(P0.05)；试验11组和田羊肝脏和肾脏AMA1.的表达极显著低于比照(P0.05)不同剂量小花棘豆均可降低和田羊内脏中AMA活性及其inRNA表达量，肝脏和肾脏是其主要作用的靶区。关键词：小花棘豆(Oxytropisg1.abraDC)；苦马豆素;-甘露糖普酷;内脏器官中图分类号：S856.9文献标识码：A文章编号：0439-8114(2016)09-2308-05小花棘豆(Oxytropisg1.abraDC)是广泛分布于新疆自然草原的有毒植物之一，具有耐旱、

3、耐贫瘠、返青早、生命力强、繁殖系数高等特性。是制约新疆草原畜牧业发展的重要因素。目前仅南疆阿克苏、和田地区F1.然草场中广泛丛生小花棘豆的面积已超过20%,每年因采食小花棘豆而中毒的家畜占放牧家畜总数的5%-10%,其中50%左右的中毒家畜死亡。中毒家畜表现为机体的广泛性损伤，剖检发觉其内脏器官多出现肿胀等炎症，病理组织学表现主要为细胞空泡变性。国内外探讨发觉,苦马豆素(Swainsonine,SW)是小花棘豆的主要毒性成分，可通过抑制-甘露糖甘酶(o1.-Mannosidase,M)活性，导致机体甘露糖代谢发生异样而发挥毒性作用。探讨表明，AVA是动物小花棘豆中毒特异性最强的指标，小花棘豆中

4、毒动物的AMA活性受到显著抑制，但对其转录、翻译、加工修饰等的影响尚不清晰。和田羊是新蝴南豳地区的主要放牧品种，占该地区绵羊存栏数的70.97%,在畜牧业生产中占有重要地位。近年来，和田羊小花棘豆中毒已成为该地区畜牧业发展面临的严峻问题。本试验通过E1.ISA.免疫组化和荧光实时定量PCRo以新强南疆地区小花棘豆为试验材料，探讨小花棘豆攻毒对和田羊内脏器官AM活性及分布、表达的影响。为揭示小花棘豆中毒机制供应基础。1材料与方法1.1.材料与试剂健康和田羊12只，雌雄各半，体重（321.4）kg,购自同一牧场。小花棘豆风干样采自阿克苏市温宿县佳木乡，由塔里木高校动物科学学院草业科学学科组鉴定。S

5、-P超敏组化试剂盒（福州迈新生物技术公司）；AMA检测试剂盒（南京建成生物技术公司）：反转录试剂盒、总RNA提取试剂盒、Rea1.-timePCR试剂盒，均购自TAKARA（大连）有限公司。1.2试验动物分组与处理试验羊随机分为比照组、试验【组和试验11组。每组4只。比照羊自由采食青干草。每只每日补饲精料300g,试验I、H组饲喂小花棘豆粉，每天分别按10gkg和20gkg的剂量与300g精料加水混匀,饲喂3次,即08：00-09：00、14：00M5：00、19：00-20：00,自由采食后饲喂青干草。自由饮水。待出现喜卧、起立困难、以手提耳出现摇头等典型中毒症状后进行屠宰，分别取肝脏、肾脏

6、、脾脏、心脏和肺脏组织，部分进行免疫组化染色分析，部分利用冰生理盐水制备10%组织匀浆液用于检测AMA活性，部分液氮保存用于检测mRN水平表达的影晌。全部解剖工具及冻存管均需用DEPC预处理。1. 3M在中毒羊内脏器官组织的分布和由羊内脏器官组织均运用鸣多聚甲醛固定，梯度酒精脱水，二甲苯透亮后进行石蜡包埋。包埋组织进行连续切片，片厚6m,二甲苯脱蜡，梯度酒精竟水,然后依据试剂盒说明操作。其中抗体稀释比为1/100,DAB显色。运用PBS为阴性比照。常规脱水，透亮，封片，光镜下视察组织病理学变更。采纳hnage-ProP1.us6.0软件对免疫组化获得照片进行分析。1.4 AMA活性测定依据试剂

7、盒说明书，采纳间接E1.ISA法测定和出羊内脏器官组织中AMA活性。详细步骤为：标准品稀释加样温育洗涤加酶温育洗涤显色终止测定。1.5 MA表达水平的测定1.5.1引物设计与合成依据GenBank中绵羊高尔基体-甘露糖昔醯H(AvA1)、溶筋体-甘露糖苗福(AVA2)和B-actin基因的核昔酸序列，采纳BeaconDesigner软件设计引物,引物见表1,由TKR(大连)有限公司合成。1.5.2 总RNA提取与cDN合成参照TAKARA总RNA提取试剂盒(D9108)说明书提取绵羊待测组织总RNA,通过检测0D260nm和琼脂糖凝胶电泳检测其完整性，将合格RNA利用gDNAEraser去除基

8、因组DNA,反应条件：424C,2min。然后采用两步法进行反转录。反应体系：PrimeScriptBuffer5x4.O1.,PrimCSCriP1.RTEnZymCMiX1.1.O1.,RTPrimerMix1.O1.,RN提取液10.O1.,RNaseFreed1.I204.01.：反应条件：37C反应15min,85反应5s,-20C保存。1.5.3 一般PCR及基因测序PCR反应体系：2xTaqPCRMasterMix1.2.51.,模板cDNA2.01.,上、下游引物各2. 01.,ddH206.51.:各反应程序为:95C预变性5min三94C变性20s,58C退火30s,72C

9、延长30s,30个循环：72C延长IOminoPCR产物送至TAKARA（大连）有限公司测序。1. 5.4实时荧光定量PCR检测和出羊内脏器官中AVA的相对表达实时荧光定量PCR反应体系：SYBRPremixExTaq210,01.,上、下游引物各0.81.,ROXReferenceDyeI1.500.41.cDNA液2.01.,RNaSeFreeddH206,01.；反应条件：95C预变性30s：95%变性5s,60退火34s,72C延长30s。40个循环：72C延长IOmino按反应体系及条件进行实时荧光定量PCR,得到各部分Ct值，采纳双标准曲线法对所得实时荧光定量PCR结果进行分析。1

10、.6 数据分析数据用SPSS16.0软件进行分析，通过One-WayANOVA方法分析单因素方差，结果用平均值标准差来表示。2结果与分析2.1AMA在和田羊内脏器官组织中的分布由图1可知，AMA在和出羊的肝脏组织、肾脏皮质区、肾脏髓质区、脾脏红微、脾脏白拗、脾脏小梁、心肌组织、肺泡组织等区域均有分布。但在肝脏中心静脉、小叶间静脉、小叶间动脉、肾小球细胞和肾小管细胞中染色极淡，表明在这些区域M表达较弱或不表达。小花棘豆攻毒羊肝细胞、肾脏皮质区和愉质区细胞、脾脏红愉、脾脏小梁中M的染色明显变淡。其中试验11组和田羊肝细胞、肾脏皮质区和髓质区细胞中AMA免疫组化染色极淡，表明这些区域M已经几乎不表达

11、。2.2 引物的牢靠性验证由图2可知，-actin在100bP左右出现条带，AMA1.和AM2基因分别在100bp和200bp间出现2条清晰条带，与试验设计的目的条带大小相符,表明引物设计良好。2.3 和出羊内脏器官AMA活性的变更由表2可知，试验组和田羊内脏器官AMA活性与比照组相比均有肯定程度的下降，其中试验I组和田羊脾脏、心脏和肺脏与试验H组和旧羊心脏、肺脏AVA活性均显著低于比照(P0.05),试验I组和田羊肝脏、肾脏和试验H组和出羊肝脏、肾脏和脾脏M活性均极显著低于比照(P0.01)试验表明，长时间、大剂量的摄食小花棘豆可显著影响和出羊内脏器官AVA活性，其中小花棘豆中毒对肝脏和肾脏

12、的影响最为明显。2.4 和田羊小花棘豆中毒对内脏器官M1在mRN表达水平的影响由表3可知，试验组和田单内脏器官中AMA1.均有表达。与比照组相比。试验I组和田羊肝羊、肾脏与试验H组和田羊脾脏AMA1.mRNA表达量显著低于比照(PO.05)o或验结果表明，大剂量、长时间的饲喂小花棘豆可显著影响和出羊肝脏、肾脏和脾脏的M1在mR-NA的表达水平。2.5 和田羊小花棘豆中毒对内脏器官M2在mRNA水平表达的影响由表4可知，通过小花棘豆的攻毒饲喂，各试验组和田羊内脏器官AM2mRNA表达量均有不同程度的下降，其中试验H组和田羊肝脏与肾脏中AMA2mRNA表达量均显著低于比照（PO.05）。试验表明，

13、小花棘豆中毒对和田羊内脏器官AMA1.mRNA表达量的影响较为显著，对AMA2mRNA表达量的影响不明显。2.6 和田羊小花棘豆中毒对脏器中M基因序列的影响经DNAStar软件分析及NCBIB1.ast比对,试验I组和田羊肺脏和心脏AMA与公布的基因序列完全一样，脾脏M与公布的基因序列重合率大于99%,表明低剂量小花棘豆中毒对和田羊肺脏、心脏及脾脏M的表达均无显著影响。试验I组和试验H组和田羊肝脏、肾脏AvA与公布的基因序列有较大差异，其中或验I组和试验I1.组和田羊肝脏M1与公布的基因序列重合率分别只有9跳和90%,肾脏AMA1.与公布的基因序列重合率分别只有93%和9遇，但各试验组和田羊M

14、2与公布的基因序列重合率均在95%以上，表明小花棘豆中毒对和田羊内脏器官中AMA1.有显著影响。3探讨小花棘豆化学成分组成困难，国内外探讨发觉小花棘豆含有生物碱、皂昔、黄阳、挥发油、酚类、有毒蛋白等多种活性物质，其中明咻里西呢类生物碱苦马豆素被多数探讨者确认为小花棘豆的主要毒性成分。目前探讨认为，苦马豆素阳离子呈半椅状结构，而甘露糠仟在的水解的过程中其阳离子也形成了半椅状的立体构型，二者极为类似，故苦马豆素对AMA具有极高的亲和性:另据化学分析表明。苦马豆素的叫跺里西口定环上结合有3个羟基，其中的顺式二醉官能团和对位的羟基可增加苦马豆素同甘露糖阳离子的相像性，分子间的氢键乂增加了苦马豆素与AM

15、A结合的特异性，并在其糖基化修饰甘露精低聚糖的过程中发挥作用，造成甘露糖代谢障碍，最终因低聚糖大量蓄积而导致动物细胞损伤。贾琦珍等探讨表明小花棘豆中毒可导致动物脏器损伤，而且肝脏指数、肾脏指数、脾脏指数与小花棘豆中毒均极显著相关(PO-O1.)0心脏指数与肺脏指数与小花棘豆中毒均显著相关(PO.05)o丁伯良等探讨认为甘肃棘豆(主要毒性成分为苦马豆素)中毒山羊组织细胞的空泡变性与M活性下降有关，本试验发觉M在和田羊内脏器官组织中均有分布，小花棘豆中毒和田羊内脏器官中AMA活性显著下降，而且与时间一剂量呈正相关。表明苦马豆索可通过影响AMA导致动物中毒。在哺乳动物细胞组织中存在3种结构形式不同的M,其主要在糖基化修饰低聚糖过程中发挥重要作用，是W聚糖成熟和降解的必要酶，也可在N-糖基化过程中加工甘露糖。不同的AM可降解各类糖蛋白中的低聚糖仟，从而影响蛋白的折叠、成熟等过程，苦马豆素与甘露糖竞争性结合M可导致糖蛋白构象及生物活性变更，中毒动物出现溶海体蓄积病的典型症状，Doug1.as等探讨发觉苦马豆素可显著影响M的表达，并认为苦马豆素对AMA的抑制不仅是因为空间结构的相像，还因为弱碱性的苦马豆素极