百日咳菌苗原液免疫力试验方法.docx

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1、百日咳菌苗原液免疫力试验方法1免疫1.1 动物选用体重1012g同性或雌雄性各半的健康NIH小白鼠。将动物随机分为三组，每组16只或20只(同性或雌雄性各半，为保证攻击后有16只或20只小白鼠，可适当多免疫几只小白鼠)，同时饲养健康小白鼠55只，备做对照用。1.2 免疫原稀释将百日咳原液用生理盐水或pH7.30.1磷酸盐缓冲生理盐水稀释至成品菌苗浓度的1/2,然后再稀释7.5X、37.5X、187.5X,百日咳参考菌苗稀释至每m1.含8IU,然后再稀释成每m1.含1.OIU(0.125m1.)0.2IU(0.025m1.)及0.04IU(0.005m1.)-1.3 免疫方法将不同稀释度的免疫原

2、分别免疫小白鼠，每只小白鼠各腹腔注射05m1.02攻击菌及攻击菌液的制备2.1 菌种小白鼠脑内攻击用58030(18323)菌株。2.2 培养基可用包-姜氏培养基(含羊血20%30%)或其他适宜的培养基。2.3 培养温度及时间放3537C培育，第一代不超过72小时，攻击时菌种的培育时间为2024小时。原代菌种放28可保存2周。2.4 攻击菌液的制备将培育2024小时的菌苔经肉眼检查为纯菌后,刮入生理盐水或pH7.30.1缓冲生理盐水，用灭菌脱脂棉过滤，测定浓度，然后用pH7.07.2水解酷素、蛋白陈水或肉汤稀释成每003m1.含菌8万，作为试验组的攻击菌液，然后再连续稀释，使每0.03m1.分

3、别含8000、800、80及8个菌，以上5个不同稀释度的菌液，作为对照组的攻击菌液。2.5 工作起止时间自攻击菌液制备（开始刮菌）至注射完最后1只小白鼠不得超过2.5小时。2.6 活菌计数在攻击前后，可将0.03m1.含8个菌的攻击菌液，接种于包一姜氏培养基或其他适宜的培养基平皿中，每个平皿0.2m1.每次不得少于2个平皿，其菌落形成单位约为浊度测定的1/4o3攻击动物免疫后14天,每只小白鼠脑内攻击0.03m1.菌液（含8万个菌）,用0.25m1.注射器，4号针头。在试验组攻击后再进行对照组毒力测定，对照组每稀释度攻击10只小白鼠。4记录结果动物攻击后观察14天。攻击后第2天，将试验组动物处理成每组16只或20只。以后逐日观察动物并记录死亡数，最初3天死亡的动物不作统计，至第14天有麻痹、头部肿胀、弓背及明显耸毛的动物按死亡计算。5结果计算5.1 按WiISOn-WOrCeSter氏法计算参考菌苗及待检菌苗的ED50SD%,每个ED50标准差的范围一般应为64%156%o5.2 按Reed-Muench氏法计算对照组1.D50,1个1.D50的菌数应不高于800个菌。5.3 计算均质性因子“”。5.41 U计算待检原液每m1.应含IU=参考菌苗ED5待检原液ED5X参考菌苗每m1.的IU数6效力评价百日咳原液按成品菌苗尝试稀释后，每个接种剂量的免疫效价应不少于4.0IUo