皮上划痕人用炭疽活菌苗制造及检定规程 冻干皮上划痕人用布氏菌病活菌苗制造及检定规程.docx

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1、皮上划痕人用炭疽活菌苗制造及检定规程本品系用弱毒炭疽菌株制成的活芽胞悬液。专供预防炭疽病之用。1菌种1.1 菌种来源为无荚膜，水肿型，具有一定残余毒力，免疫原性较好的A16R菌株。由中国药品生物制品检定所分发或经同意。1.2 菌种应以冻干法或用50%(mlml)甘油保存。每35年应全面检定其培养特性、残余毒力、安全性及免疫力，建立种子批。生产前只检查菌形，培养特性及噬菌体特异性。1.3 菌种检定1.3.1 培养及生化特性在牛肉消化液琼脂或其他适宜固体培养基上生长，菌落为灰白色，不透明，呈卷发状。为革兰氏阳性大杆菌，呈链状排列。无运动力。能够形成芽胞。液体培养呈絮状发育，在血清培养基上不形成荚膜

2、。能发酵葡萄糖、麦芽糖、蔗糖,不分解水杨昔。1.3.2 残余毒力试验用体重350400g健康豚鼠5只，各皮下注射0.5亿/ml的牙包悬液ImL另用体重1820g小白鼠5只，各皮下注射0.5亿/ml的芽胞悬液0.1ml。观察10天，3只以上动物应出现水肿，可有特异死亡。但脏器涂片只应找到无荚膜的本菌。若全部动物不出现水肿，应重试。重试仍无水肿，菌种不得用于生产。1.3.3安全试验用体重2.02.5kg分健康家兔10只，各皮下注射2.5亿/ml的芽胞悬液1ml,观察10天，在注射部位可出现水肿，全部动物应活存。如有死亡，应用同数动物重试，重试仍有死亡，菌种不得用于生产。1.3.4 免疫力试验上述安

3、全试验动物于注射后1820天，用炭疽毒菌攻击，各皮下注射20个MLDo同时用同体重的健康家兔3只，各皮下注射1个MLD作为对照。观察10天，对照动物死亡3只。试验组保护60%；对照组死亡2只，试验组保护80%为合格。对照动物死亡1只或无死亡，为对照不成立，应重试。2制造制造菌苗的工作室及设备应当专用，不得与其他细菌工作混用。生产中应严格执行无菌操作，非制造菌苗用的其他炭疽菌株不得带到生产工作室内。2.1 菌种接种牛肉消化液琼脂或其他适宜固体培养基，于34。C培育1820小时，经检查为纯菌者，保存于28,在2周内供作生产种子用。2.2 培养基用pH7.27.4牛肉消化液琼脂或其他培养基。2.3

4、种子将供制造用菌种，移种于牛肉消化液中。于34。C培育2024小时，检查其生长特性、菌形及纯度，应符合1.3.1项要求。2.4 接种经检查合格之种子培养物，接种于牛肉消化液琼脂上，置3334C培育。成熟的典型芽胞达至80%以上、无杂菌者采集。2.5 采集将培养物刮入50%(mlml)甘油蒸储水原液瓶内，振摇使成均匀悬液。每瓶取样按生物制品无菌试验规程进行纯菌试验。2.6 合并将纯菌试验合格之原液进行合并分批，取样做纯菌试验、浓度测定及活菌计数。2.6.1 纯菌试验按生物制品无菌试验规程进行。2.6.2 浓度测定按中国细菌浊度标准测定浓度。2.6.3 活菌计数取0.5亿/ml的菌液1ml,按10

5、倍系列稀释至10工取0-5稀释菌液接种5个平皿，每个平皿接种0.1ml。置37培育24小时，计算每ml菌苗的芽胞活存率。芽胞活存率在50%以上为合格。2.7 稀释分装2.7.1 稀释用灭菌的50%甘油蒸储水将原液稀释成每ml含芽胞40亿个，即为皮上划痕用菌苗。同批原液稀释之菌苗为作1批。稀释若干大瓶时,应按瓶号分为亚批。2.7.2 分装皮上划痕用菌苗按20人份/ml分装。规格为每安甑1或2ml,抽样进行成品检定。3成品检定3.1 物理检查应为灰白色之均匀悬液，无异物及摇不散之菌块。3.2 纯菌试验按生物制品无菌试验规程进行。3.3 浓度测定按中国细菌浊度标准测定浓度，应为每ml含菌40亿20%

6、3.4 活菌计数按2.6.3项进行。3.5 安全试验每批菌苗用体重2.02.5kg,健康家兔5只，各皮下注射2.5亿/ml的芽胞悬液ImL观察10天。可有水肿，全部动物应活存。如有死亡，应用加倍量动物重试。如仍有死亡，判为不合格。3.6 免疫力试验每5批菌苗或不足5批者，至少抽检1批（可利用安全试验的动物）按134项进行。4保存与效期应保存于28。自检定合格之日起效期为2年。皮上划痕人用炭疽活菌苗使用说明书严禁注射！本品系用弱毒炭疽菌株制成的50%甘油活芽胞悬液。专供预防炭疽病之用。本品为灰白色均匀悬液，无异物或摇不散的菌块。接种对象炭疽病常发地区人群、皮毛加工与制革工人、放牧员以及其他与牧畜

7、密切接触者，应每半年或1年接种1次。用法1 .用消毒注射器吸取菌苗，在消毒过的上臂外侧上部滴菌苗两滴，相距34cmo划痕时用手将皮肤绷紧，用消毒划痕针在每滴菌苗处作“井”字划前，每条痕长约11.5cm。划破表皮以现出间断小血点为度。2 .用同一划痕针反复涂压，使菌苗充分进入划痕处。接种后局部应裸露至少510分钟，然后用消毒干棉球擦净。3 .接种后24小时划痕部位无任何反应者应重新接种。林己患严重疾病、免疫缺陷症、严重皮肤病患者，用免疫抑制剂治疗者，有严重过敏史者不予接种。注射事项1 .本品仅供皮上划痕用，严禁注射。2 .凡制品内有摇不散的菌块或安甑有裂纹、过失效期等均不能使用。3 .用前应将菌

8、苗充分摇匀。消毒皮肤只用酒精，不用碘酒。4 .菌苗安瓶启开后，应于3小时内用完。5 .剩余菌苗，空安甑及用具，需用3%碱水煮沸消毒30分钟。保存应保存于28。冻干皮上划痕人用布氏菌病活菌苗制造及检定规程本品系采用布氏菌弱毒菌株，经培育后冻干制成。用于预防布氏菌病。1菌种1.1 用弱毒牛型104M菌种。菌种应由中国药品生物制品检定所分发或经同意。1.2 菌种应经冻干，保存于28C,并指定专人负责保管。1.3 禁止使用通过动物后再分离培育出之菌株制造菌苗。1.4 菌种的免疫力试验每3年至少检定一次。1.5 菌种检定1.5.1 培养特性在含有1：50000碱性复红培养基上应生长，但在含有同样浓度的硫

9、堇培养基上不应生长（亦可用纸片法检查），在肝琼脂斜面培养基上产生微量硫化氢。涂片镜检应为革兰氏阴性球杆菌。1.5.2 变异检查用生理盐水将新鲜培养物制成含菌数为25亿30亿/ml的菌悬液，置90水浴中30分钟，不应出现凝集现象。用同样浓度的菌悬液，与1：1000三胜黄素水溶液等量混合，于37放24小时，不应出现凝集现象。用结晶紫菌落染色法检查，菌落变异率不得超过3%。1.5.3 噬菌体裂解试验将菌种接种于肝琼脂平皿上，滴加布氏菌Tb噬菌体1滴，于37培育4448小时，在噬菌体流过的地方应无本菌生长。1.5.4 血清学试验用生理盐水将新鲜培养物制成含菌数为50亿/ml的菌悬液,与已知效价的布氏菌

10、诊断血清作凝集反应，其凝集价应达到血清原效价。1.5.5 残余毒力检查用生理盐水将37。C培育4448小时之肝琼脂斜面新鲜培养物制成菌悬液,并稀释成15亿/ml、30亿/ml、60亿/ml、120亿/ml和240亿/ml等5个浓度的菌悬液。取体重1820g小白鼠25只分为5组，各组分别用不同浓度的菌悬液腹腔注射，每只0.5ml,观察7天，计算LD50,其值应为1020亿菌。1.5.6 免疫力试验用生理盐水将菌种1代新鲜培养物制成浓度为2亿/ml的菌悬液。取体重300350g豚鼠10只。每只皮下注射1ml,经2530天后，每只豚鼠皮下攻击羊型强毒布氏菌10个或20个感染量（MlD）。同时取3组健

11、康豚鼠作对照，每组3只，分别于各组豚鼠皮下注射0.5、1及2个MID。免疫及对照豚鼠于注射毒菌悬液后均观察2530天后解剖，取出鼠蹊部淋巴结、腹主动脉旁淋巴结、肝及脾分别接种肝琼脂中管斜面培养基，于37培育10天。如免疫动物组织之培养物有布氏菌生长，应用硫堇染科培养基（亦可用纸片法）和硫化氢反应做菌型鉴别试验。注射1个MID的3只对照豚鼠都必须发生全身感染，即肝脏或脾脏应分离出羊型毒菌。免疫组攻击10个MID时，10只豚鼠中不应有2只以上分离出羊型毒菌；攻击20个MID时，10只豚鼠中不应有3只以上分离出羊型毒菌。2菌苗制造2.1 制造菌苗的工作室应专用，不得与其他细菌工作混用。生产中应严格执

12、行无菌操作，非制造菌苗用的其他布氏菌不得带到生产工作室内。2.2 制造菌苗可用pH6.67.2的肝浸液琼脂或其他适宜培养基。2.3 启开冻干菌种，接种在肝琼脂斜面或其他适宜的培养基上，放37培育4448小时为第1代。第1代菌须进行1：500三胜黄素玻片凝集试验，只有光滑型菌方可用于制造菌苗。第1代菌种斜面于28可保存15日。2.4 将第1代菌种接种到肝琼脂或其他适宜培养基上，放37。C培育4448小时为第2代菌种。经肉眼纯菌检查合格后，弃去凝固水，用无菌生理盐水制成菌悬液。2.5 将第2代菌种接种到琼脂或其他适宜培养基上，放37。C培育4448小时，肉眼逐瓶检查，有杂菌者废弃。2.6 用含有蔗

13、糖、明胶、硫月尿和味精组成的保护液或其他适宜的保护液洗下菌苔或刮取菌苔,放入保护液内。每数瓶培养物可采入或刮入1瓶（或1大管）保护液内，此为菌苗原液，置28。C保存。每瓶（或大管）原液均按生物制品无菌试验规程进行纯菌试验。2.7 将纯菌试验合格的原液合并，如每安甑冻干菌苗为10人份，装量0.5ml原液，则应合并后的原液稀释成每ml含菌1800亿2000亿，使每1人份菌苗含90亿100亿。由原液采集到冷冻干燥之间隔不得超过7天。稀释后的原液经纯菌试验合格后即可分装安甑冻干。2.8 同一日采集的原液同一次冻干者为1批。如1批有数瓶，应分为亚批。3冷冻干燥菌苗原液分装安甑完毕后应立即在-30以下进行

14、冷冻。干燥时间可根据水分含量及活菌数来决定。干燥完毕后进行真空封口。亦可用充氮封口。4成品检定4.1 物理化学检查冻干菌苗应为乳白色疏松体，加入生理盐水后，应于1分钟内溶解成均匀悬液。用真空测定器检查安甑应为真空。水分含量不得超过3%。4.2 菌型检查每亚批菌苗应用硫堇培养基或纸片法及硫化氢反应做菌型鉴别检查，应呈牛型布氏菌的培养特性。4.3 纯菌试验每亚批菌苗抽样按生物制品无菌试验规程进行。4.4 活菌计数及菌落变异检查每亚批取3支安甑，加生理盐水溶解混匀后比浊。将菌液浓度稀释为含菌10亿/ml,再用生理盐水做10倍系列稀释至IOq取10-6或其他适宜的稀释度之菌液接种5个平皿，每个平皿接种

15、0.1mlo用涂菌棒涂匀后放37培育45天，计算活菌数。冻干后活菌率不得少于50%,如不合格可复试，经复试仍低于50%者则该批菌苗废弃。同时用结晶此菌落染色法检查，菌落变异率不得超过10%。4.5 浓度测定菌苗经溶解后，按中国细菌浊度标准测定浓度，每人份含菌数应为90亿100亿。4.6 安全试验每亚批取3支安甑，用生理盐水溶解后混匀。用体重1820g小白鼠5只，每只皮下注射10亿菌/ml的菌悬液0.5ml。观察7日不应有死亡，如有死亡应复试一次，仍有死亡，则该批菌苗废弃。4.7 免疫力试验10批以下者至少抽1批进行免疫力试验，10批以上者,每10批抽1批。用灭菌生理盐水溶解冻干菌苗，并稀释成5亿菌/ml菌悬液。取体重300350g豚鼠10只，每只皮下注射ImL经2530日后，每只豚鼠皮下攻击羊型线毒布氏菌10个或20个MIDo同时用3组健康豚鼠作对照，每组3只，各组豚鼠分别于皮下注射0.5、1和2MID。各组不能自拔于注射毒菌悬液后2530日解剖，取鼠蹊部淋巴结、腹主动脉旁淋巴结、肝及脾,分别接种肝琼脂中管斜面培养基，于37培育10天。如免疫动物组织之培养物有布氏菌生长，需用