应用生物化学2.ppt

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1、离离 心心 技技 术术应用生物化学应用生物化学 第二章第二章离心技术（离心技术（centrifugal techniquecentrifugal technique）n 是根据颗粒在匀速圆周运动时受到是根据颗粒在匀速圆周运动时受到一个外向的离心力的行为发展起来的一个外向的离心力的行为发展起来的一种分离分析技术。一种分离分析技术。一、离心技术的应用一、离心技术的应用n 1. 1.用于生物、医学、化学等实验室分析研用于生物、医学、化学等实验室分析研究的，转速从每分钟几千到几万转以上，此究的，转速从每分钟几千到几万转以上，此类技术的使用目的在于分离和纯化样品，以类技术的使用目的在于分离和纯化样品，以

2、及对纯化的样品有关性能进行研究。及对纯化的样品有关性能进行研究。n 2.2.用于工业生产的，如化工、制药、食品用于工业生产的，如化工、制药、食品等工业大型制备用的离心技术，转速都在每等工业大型制备用的离心技术，转速都在每分钟分钟50005000转以下。转以下。二、离心机基本组件二、离心机基本组件n1.1.低速离心机低速离心机 转子转子 速度控制系统速度控制系统n最高转速在最高转速在6000rpm6000rpm以下以下n实验室中常用于实验室中常用于分离制备。分离制备。n 2. 2.高速离心机高速离心机 系列转子系列转子 速度控制系统速度控制系统 温控系统温控系统n最高转速在最高转速在25,000

3、rpm25,000rpm以下以下n常用于生物大分子常用于生物大分子的分离制备的分离制备n 3. 3.超速离心机超速离心机 系列转子系列转子 速度控制系统速度控制系统 温度控制温度控制 真空系统真空系统n 常用于分离亚细常用于分离亚细胞器、病毒粒子、胞器、病毒粒子、DNADNA、RNARNA和蛋白质和蛋白质分子。分子。 转子转子(Rotor)(Rotor)n固定角式转子固定角式转子(fixed-angle rotor)(fixed-angle rotor)n水平转子水平转子(Swing-bucket rotor)(Swing-bucket rotor)n垂直转子垂直转子(vertical rot

4、or)(vertical rotor)n带状转子带状转子(zonal rotor)(zonal rotor)n连续转子连续转子(continuous rotor) (continuous rotor) 1.1.固定角式转子固定角式转子n离心管在离心机中离心管在离心机中放置的位置与旋转放置的位置与旋转轴心形成一个固定轴心形成一个固定的角度的角度, ,角度变化在角度变化在14-4014-40之间。之间。 固定角式转子固定角式转子角式转子的特点：角式转子的特点： （1 1）重心低）重心低, ,转速可较高转速可较高 （2 2）样品粒子穿过溶剂层的距离略大于离心管）样品粒子穿过溶剂层的距离略大于离心管的

5、直径的直径; ; （3 3）“管壁效应管壁效应”： 有一定的角度有一定的角度, , 在离心过程中撞到离心管外壁在离心过程中撞到离心管外壁的粒子沿着管壁滑到管底形成沉淀的粒子沿着管壁滑到管底形成沉淀, , 此效应使最后此效应使最后在管底聚成的沉淀较紧密。在管底聚成的沉淀较紧密。2.2.水平转子水平转子n（1 1）转子静止时）转子静止时, ,处在转子中的离心管中心线与处在转子中的离心管中心线与旋转轴平行；旋转轴平行；n（2 2）转子旋转加速时）转子旋转加速时, ,离心管中心线由平位置逐离心管中心线由平位置逐渐过渡到垂直位置渐过渡到垂直位置, ,即与旋转轴成即与旋转轴成9090角。角。n水平转子的特

6、点：水平转子的特点：n（1 1）转子的重心位置较高）转子的重心位置较高n（2 2）样品粒子沉降穿过溶剂层的距离大于直径）样品粒子沉降穿过溶剂层的距离大于直径n（3 3）对于多种成分样品分离特别有效）对于多种成分样品分离特别有效n（4 4）常用于）常用于速率区带离心速率区带离心和和等密度离心等密度离心三、基本原理三、基本原理n1.1.转速转速 （1 1）rpmrpm Revolutions Per Minute 为每分钟转速（转/分）（2 2）角速度：每秒转过的弧度弧度数(弧度/秒) 1 1 弧度弧度即为弧长等于半径的圆弧所对的圆心角 2rpm2rpm6060n2.2.离心力离心力 Centri

7、fugal force (F)Centrifugal force (F) F F离心力离心力= m= m2 2r r m: m: 质量质量 : : 旋转角速度旋转角速度 r r：旋转体离旋转轴的距离：旋转体离旋转轴的距离n3.3.相对离心力相对离心力 Relative centrifugal Relative centrifugal force (force (RCFRCF) ) RCF RCF就是实际离心力转化为重力加速度的倍就是实际离心力转化为重力加速度的倍数，通常用数，通常用g表示表示 RCFRCF F F离心力离心力/F/F重力重力 mm2 2r/mg=r/mg=2 2r/gr/g 1

8、.118 10-5 (rpm)2 r半径半径n4.4.离心转速换算公式（离心转速换算公式（rpm与与g）离心速度离心速度1000rpm与与1000g有什么区别？有什么区别？ （Eppendorf 5415C 1000g 对应 3066rpm） （BOECO M-24 1000g 对应 3222rpm） g（RCF）1.118 10-5 (rpm)2 r半径半径 运用离心力列线图换算运用离心力列线图换算rpm与与g离心力列线图离心力列线图n5.5.沉降系数沉降系数 Sedimentation coefficient (S)n 样品颗粒的大小样品颗粒的大小 形状形状 密度密度 溶剂的粘度、密度溶剂

9、的粘度、密度 离心加速度离心加速度n S= S= X X1 1: : 离心前粒子离旋转轴的距离离心前粒子离旋转轴的距离X X2 2: : 离心后粒子离旋转轴的距离离心后粒子离旋转轴的距离2.12.110102 2logXlogX2 2/X/X1 1rpmrpm2 2 (t (t2 2-t-t1 1) )n6.6.沉降速度沉降速度 Sedimentation velocitySedimentation velocityn定义：定义：指在强大离心作用下，单位时间内物指在强大离心作用下，单位时间内物质运动的距离。质运动的距离。V=V= d d2 2 ( (p p- -m m) )1818 d d：球

10、形粒子的直径：球形粒子的直径p p：粒子的密度：粒子的密度m m：介质的密度：介质的密度：流体介质的粘度数：流体介质的粘度数 r r：粒子距离心轴垂直半径：粒子距离心轴垂直半径 四、离心分离方法四、离心分离方法n制备型超高速离心机的几种分离方法：制备型超高速离心机的几种分离方法：nA A差速离心：差速离心： 速率区带法速率区带法（rate zonal）nB B密度梯度离心法：密度梯度离心法： 等密度离心法等密度离心法（isopycnic） A A差速离心：差速离心：n利用不同的粒子在离心力场中沉降的差别,在同一离心条件下,沉降速度不同,通过不断增加相对离心力,使一个非均匀混合液内的大小、形状大

11、小、形状不同的粒子分步沉淀。n差速离心的特点是操作简单，但分离纯度不高。主要细胞成分的大小主要细胞成分的大小n细胞核细胞核 4-12 mn质膜质膜 3-20 mn高尔基体高尔基体 1-2 mn线粒体线粒体 0.4-2.5 mn溶酶体溶酶体/过氧化物酶过氧化物酶 0.4-0.8 mn微粒小泡微粒小泡 0.05-0.3m匀浆组织的差速离心（匀浆组织的差速离心（）1000g/10 min去掉上清去掉上清3000g/10 minetc.匀浆组织的差速离心（匀浆组织的差速离心（）1.组织匀浆组织匀浆 1000g for 10 min2.上清上清 from 1 3000g for 10 min3.上清上清

12、 from 2 15,000g for 15 min4.上期上期 from 3 100,000g for 45 minn1000g 1000g 沉淀沉淀: : 细胞核细胞核, ,质膜层质膜层n3000g 3000g 沉淀沉淀: : 大线粒体大线粒体, ,高尔基管高尔基管n15,000g15,000g沉淀沉淀: :小线粒体小线粒体, ,溶酶体溶酶体, ,过氧化物酶过氧化物酶n100,000g 100,000g 沉淀沉淀: : 微粒微粒 差速离心（差速离心（）固定角转子固定角转子:短沉淀路径短沉淀路径 Fmax Fmin水平转子水平转子:长沉淀路径长沉淀路径 Fmax Fmin 密度屏障密度屏障不

13、连续梯度不连续梯度 连续梯度连续梯度B B、密度梯度离心、密度梯度离心对不同粒子怎样进行密度梯度分离对不同粒子怎样进行密度梯度分离? ?低密度低密度高密度高密度中等密度中等密度n p p=m m 即即 p p-m m=0 V=0 =0 V=0 粒子平衡粒子平衡n p pm m 即即 p p-m m0 V0 0 V0 粒子达到某一位置后就达到平衡粒子达到某一位置后就达到平衡n p pm m 即即p p-m m0 V0 0 V0 粒子逆着离心方向上浮粒子逆着离心方向上浮V=V= d d2 2 ( (p p- -m m) )1818从方程式预测从方程式预测 密度梯度离密度梯度离心过程心过程15234

14、1）速率区带法（）速率区带法（rate zonal）n根据样品中不同粒子所具有的不同的尺寸大小及沉降速率根据样品中不同粒子所具有的不同的尺寸大小及沉降速率（S S）分离。）分离。n将所需分离的样品小心地加至密度梯度溶液的顶部顶部。样品在梯度溶液表面形成一负梯度。由于不同大小的粒子在离心力作用下，在梯度中移动的速度不一样，所以经过离心后会形成几条分开的样品区带。n注意：注意：样品粒子的密度（样品粒子的密度（ p p）必须大于必须大于梯度液注中任一梯度液注中任一点的密度（点的密度（m m ）。离心过程必须在区带到达管子底部前）。离心过程必须在区带到达管子底部前停止。停止。50000rpm15min

15、50000rpm20minSTOP2）等密度离心法（）等密度离心法（isopycnic）n根据粒子的不同密度来分离。离心过程中，粒子会根据粒子的不同密度来分离。离心过程中，粒子会移至与它本身移至与它本身密度相同密度相同的地方形成区带。的地方形成区带。n 密度梯度的选择要使密度梯度的选择要使梯度的范围包括所有待分梯度的范围包括所有待分离粒子的密度离粒子的密度。样品可以在密度梯度液粒上面或均。样品可以在密度梯度液粒上面或均匀分布在密度梯度中。经离心后，样品粒子达到它匀分布在密度梯度中。经离心后，样品粒子达到它们的平衡点。们的平衡点。n注意：注意：平衡后粒子的分离完全由其密度决定，平衡后粒子的分离完

16、全由其密度决定，与时与时间无关。间无关。 123粒子密度（粒子密度（ p p） 最大介质密度（最大介质密度（m m ） 等密度离心法等密度离心法 不连续梯度不连续梯度等密度离心法的离心结果等密度离心法的离心结果 连续梯度连续梯度 密度屏障密度屏障III五五. . 梯度溶液的制备梯度溶液的制备n( (一一).).梯度材料的选择原则梯度材料的选择原则: :n1 1、与被分离的生物材料不发生反应。、与被分离的生物材料不发生反应。n2 2、可达到要求的密度范围、可达到要求的密度范围, ,且在所要求的密且在所要求的密度范围内度范围内, ,粘度低粘度低, ,渗透压低渗透压低, ,离子强度和离子强度和pHpH变变化较小。化较小。n3 3、不会对离心设备发生腐蚀作用。、不会对离心设备发生腐蚀作用。n4 4、容易纯化、容易纯化, ,价格便宜或容易回收。价格便宜或容易回收。n5 5、浓度便于测定、浓度便于测定, ,如具有折光率。如具有折光率。（二）常用的梯度材料：（二）常用的梯度材料： n糖类糖类: : 蔗糖蔗糖、甘油、甘油、聚蔗糖聚蔗糖、右旋糖酐、糖原、右旋糖酐、糖原n无机盐类无机盐类: :CsCl(C