分子生物学实验.ppt

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1、分子生物学实验安排实验项目1. E.coli重组表达GFP；2. 利用杆状病毒在昆虫细胞中表达GFP；3. 组装慢病毒表达目的蛋白。三周（周六、周日）1. 总RNA的抽提：从病毒感染的sf9中抽提总RNA2. RT-PCR：以总RNA为模板克隆eGFP基因3. 原核表达载体的构建：构建pET28a-GFP4. 感受态细胞的制备：制备BL21（DE3）感受态细胞5. 原核诱导表达GFP：6. 构建克隆GFP的重组杆状病毒：在sf9细胞中表达GFP。7. 构建克隆RFP的慢病毒：8. GFP的表达与鉴定第2周第3周第4周时间节点：3月11日序号序号实验内容实验内容并行实验并行实验1（上午）（上午）

2、总总RNA的抽提的抽提2RT-PCR克隆克隆pET28a质粒的制备质粒的制备3（下午）（下午）PCR产物的纯化产物的纯化4PCR产物的酶切和回收产物的酶切和回收pET28a质粒的酶切回收质粒的酶切回收5构建重组质粒构建重组质粒pET28a-eGFP：载体和克隆片段的连接：载体和克隆片段的连接6BL21(DE3) 感受态细胞制备感受态细胞制备时间节点：3月12日序号序号实验内容实验内容并行实验并行实验1（上）（上）pET28a+eGFP连接产物转化连接产物转化BL21(DE3) 2pFastBacHTA质粒的抽提质粒的抽提及酶切和纯化及酶切和纯化3（下）（下）构建重组质粒构建重组质粒pFastB

3、acHTA-eGFP：载体和克隆片段的连接载体和克隆片段的连接4pFastBacHTA+eGFP连接产物转化连接产物转化TG1513日下午挑斑接种培养日下午挑斑接种培养时间节点：3月18日序号序号实验内容实验内容并行实验并行实验1（上午）（上午）菌液菌液PCR鉴定重组克隆鉴定重组克隆2pET28a-eGFP的抽提的抽提pFastBacHTA-eGFP的抽提的抽提3（下午）（下午）重组质粒的酶切鉴定重组质粒的酶切鉴定4pET28a-eGFP双酶切双酶切pFastBacHTA-eGFP双酶切双酶切5pFastBacHTA-eGFP转化转化DH10Bac6重组克隆诱导表达重组克隆诱导表达时间节点：3

4、月19日序号序号实验内容实验内容并行实验并行实验1（上午）（上午）SDS-PAGE分析重组蛋白的表达分析重组蛋白的表达2（下午）（下午）Western Blot鉴定重组蛋白鉴定重组蛋白320日蓝白斑筛选重组克隆：挑斑接种培养日蓝白斑筛选重组克隆：挑斑接种培养时间节点：3月25日1. 重组Bacmid的抽提与鉴定时间节点：3月26日1. Bacmid转染sf9细胞，制备重组病毒2. 慢病毒载体转染293T细胞制备慢病毒3. 3日后，即3月29日通过荧光显微镜观察细胞状态及发荧光情况。试剂安排 69人上课 按照4人一组进行分组，共17组 教室：512；517. 每组一套试剂和工具一、总RNA的抽提

5、（一人一份,3.26）1.目的：学习总RNA的抽提以及RNA的操作。2.试剂： 细胞：每组一瓶 Trizol：RNAiso 氯仿： 异丙醇 DEPC水 70%的乙醇：DEPC水配制 DNase/RNase-Free Tips and Tubes 逆转录酶： 引物 DEPC水 dNTPmix操作注意事项：1. 全程戴一次性手套操作；2. 涉及RNA的操作时尽量不要开口说话；3. 涉及RNA的操作时尽量不要在四周走动；4. 取用试剂后及时封盖。操作步骤1. 细胞匀浆细胞匀浆：感染病毒4天的sf9细胞 剧烈摇晃细胞瓶使细胞脱落下来； 每人取1ml细胞培养物于RNase和DNase Free的EP管中

6、；1000rpm，4C离心5min； 弃去上清，并倒置于吸水纸上1分钟； 加入1 ml的RNAiso Plus，反复振荡数次使细胞完全裂解； 可用移液枪反复吹吸直至裂解液中无明显沉淀。 室温静置5分钟。 2. Total RNA的提取的提取 向匀浆裂解液中加入200L氯仿（RNAiso Plus的1/5体积量），盖紧离心管盖； 用手剧烈振荡15秒（氯仿沸点低、易挥发，振荡时应小心离心管盖突然弹开）； 待溶液充分乳化（无分层现象）后，再室温静置5分钟。 12,000 g， 4离心15分钟。 从离心机中小心取出离心管（勿晃动），此时匀浆液分为三层，即：无色的上清液、中间的白色蛋白层及带有颜色的下层

7、有机相。 吸取上清液转移至另一新的离心管中（切忌吸出白色中间层）。 向上清中加入等体积的异丙醇，上下颠倒离心管充分混匀后，在室温下静置10分钟。 12,000 g， 4离心10分钟。一般在离心后，试管底部会出现沉淀。 3. RNA沉淀的清洗沉淀的清洗 小心弃去上清，缓慢地沿离心管壁加入DEPC配制的75乙醇1ml（切勿触及沉淀）； 轻轻上下颠倒数次，12,000 g， 4离心5分钟后小心弃去上清；4. RNA的溶解的溶解 室温自然晾干沉淀25分钟 加入20l的RNase-free水溶解沉淀 必要时可用移液枪轻轻吹打沉淀，待RNA沉淀完全溶解后-80保存，或暂时于冰上保存。 取10 l总RNA与

8、10 x Loading Buffer混合与1% agarose gel凝胶电泳。 100V，电泳20min，拍照记录。 剩余的RNA样品用于RT-PCR二、 RT-PCR克隆目的基因1. 逆转录合成第一链cDNA；2. PCR扩增目的基因；3. PCR产物的纯化；4. 制备目的DNA克隆片段2.1 逆转录合成第一链cDNA（一组一份）建议：大家使用3L总RNA样品2.2 PCR扩增目的基因（一人一份）试剂试剂浓度浓度用量用量H2O/3510 x PCR buffer/5d NTP mix10mM1引物110M2引物210M21st cDNA3Taq DNA酶2 U/l1总体积501、PCR反

9、应体系2.2. 充分混匀后充分混匀后用用markermarker笔标记好，然后放入笔标记好，然后放入PCRPCR仪中，仪中，按下列条按下列条件进行反应：件进行反应：94 C, 5min94 C, 0.5min55 C, 30 sec72 C, 1min72 C, 10min4 C,3. 取5 l PCR产物1% agarose gel电泳分析PCR：有或无？大小？30次循环次循环2.3 pET28a质粒的制备(一组一份)1. 目的：学习质粒DNA的抽提方法2. 操作步骤实验步骤1. 硅膜法抽提质粒DNA取取3 ml TG1挑斑培养过夜的菌液，挑斑培养过夜的菌液，12,000g,离心离心1 mi

10、n，弃尽上清。，弃尽上清。加加250 l S1 重悬细菌沉淀，悬浮需均匀，不应留有小的菌块。重悬细菌沉淀，悬浮需均匀，不应留有小的菌块。加加250 l S2，温和并充分地上下颠倒数次混合均匀，使菌体充分裂解，直至形成透亮的溶液。此，温和并充分地上下颠倒数次混合均匀，使菌体充分裂解，直至形成透亮的溶液。此步骤不宜超过步骤不宜超过5 min。加加350 l S3，温和并充分地上下颠倒数次，温和并充分地上下颠倒数次，12,000g 离心离心5 min。吸取步骤吸取步骤4 中离心产生的上清并转移到制备管中（之前置于中离心产生的上清并转移到制备管中（之前置于2 ml 离心管），离心管），12,000g离

11、心离心1 min，弃滤液。弃滤液。将制备管置回离心管，加将制备管置回离心管，加500 l W1，12,000g 离心离心1 min，弃滤液。，弃滤液。将制备管置回离心管，加将制备管置回离心管，加700 l W2，12,000g 离心离心1 min，弃滤液；以同样的方法再用，弃滤液；以同样的方法再用700 l W2 洗涤一次。弃滤液。洗涤一次。弃滤液。将制备管置回将制备管置回2 ml 离心管中，离心管中，12,000g 离心离心1 min。 取出制备管移入新的取出制备管移入新的1.5 ml 离心管（试剂盒内提供）中，在制备管离心管（试剂盒内提供）中，在制备管膜中央加膜中央加30 l 预热预热的的

12、去离子水，室温静置去离子水，室温静置1 min。12,000g 离心离心1 min。 洗脱下来的溶液即质粒洗脱下来的溶液即质粒DNA样品。样品。 取取5 l DNA样品样品1%Agarose凝胶电泳检测。凝胶电泳检测。2.4 PCR产物的纯化（一组一份）此实验方法针对DNA样品中75bp以上的DNA进行纯化，去除小分子DNA、寡核苷酸链、单核苷酸、盐离子、蛋白质等。可用于： PCR产物的纯化 DNA酶切产物的纯化其原理：硅柱法分离DNA硅柱吸附法1.合并PCR产物至150 l。注：若PCR产物不足150 l，用水补足。2.在PCR产物中，加入450 l的 PCR-A。3.混合均匀后转移到制备管

13、中，将制备管置于2 ml 离心管，12,000g 离心1 min，弃滤液。4.将制备管置回2 ml 离心管，加700 l W2，10,000rpm 离心1 min，弃滤液。5.将制备管置回 2 ml 离心管，加 400 l W2，10,000rpm离心1 min；6.将制备管置于洁净的1.5 ml 离心管中，在制备管膜中央加 60 l ddH2O (65预热)，室温静置1 min。7.10,000rpm 离心1 min 洗脱DNA。即离心下来的溶液即为纯化的PCR样品。8.每组取5 l样品1%Agarose凝胶电泳。三、载体与目的DNA克隆片段的制备(一组一份)1. 目的：利用双酶切PCR产物

14、制备载体与目的DNA克隆片段2. 材料： QuickCut-EcoRI QuickCut-HindIII QuickCut-Buffer双酶切体系：试剂试剂用量用量载体50lQuickCut-EcoRI2lQuickCut-HindIII2l10 x QuickCut Buffer5lH2O41l总体积100l 混匀上述反应体系，37C水浴60min； 酶切产物的纯化：同PCR产物的纯化，最后用25l水洗脱。试剂试剂用量用量PCR纯化产物50lQuickCut-EcoRI2lQuickCut-HindIII2l10 x QuickCut Buffer5lH2O41l总体积100l四、 pET2

15、8a-GFP表达载体的构建（一组一份）1. 目的：学习利用逆转录PCR克隆目的基因以及克隆基因重组表达载体的构建；2. 材料： pET-28a/ EcoRI + HindIII： 内切酶：EcoRI + HindIII 连接酶：Solution I Kan平板： DNA酶切/PCR产物纯化试剂盒：4.1目的基因DNA与载体的连接（一组一份）连接反应：试剂试剂用量用量pET-28a/EcoRI +HindIII2ulPCR/EcoRI +HindIII8ul连接酶Solution I10ul总体积20ul 室温，连接过夜。4.2 BL21(DE3)4.2 BL21(DE3)感受态细胞的制备（感受

16、态细胞的制备（1 1人一份）人一份）1. 实验目的：掌握常规的化学法制备大肠杆菌感受态细胞的方法实验注意事项1. 接种培养示范；2. 每组一管5ml LB液体培养基；3. 除离心和培养外，所有操作均在超净工作台完成。2、实验步骤1.于超净台中，按1%（V/V）的接种量，即取50 L大肠杆菌BL21(DE3)菌液接种于5mL LB液体培养基中。（一组接种一管）;2.37摇床培养1.52.0 h至OD600为0.4左右，此时大肠杆菌培养液呈现出一种“雾”状。3.将装有大肠杆菌培养液的试管置于冰水浴中预冷10分钟。4.于超净台中，取1.5mL大肠杆菌BL21(DE3)菌液至1.5mL Eppendorf管中，4，4,000rpm，离心5min。（每人做一份）；5.弃尽上清液，加入1ml预冷的100mmol/L CaCl2溶液，轻弹管壁重悬菌体沉淀，使之混匀，4恒温，4000rpm离心5min。6.弃尽上清液，加入0.5ml预冷的100mmol/L CaCl2溶液，冰水浴中放置30min。4恒温，4000rpm离心5min。7.弃上清液，将菌体沉淀用100L预冷的的100mmol/L CaCl