分子生物学第6章+分子生物学研究方法(下).ppt

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1、第六章 分子生物学研究法（下） 基因功能研究技术6.1 基因表达研究技术基因表达研究技术6.2 基因敲除技术基因敲除技术6.3 蛋白质及蛋白质及RNA相互作用技术相互作用技术6.4 基因芯片及数据分析基因芯片及数据分析6.5 利用酵母鉴定靶基因功能利用酵母鉴定靶基因功能6.6 其他分子生物学技术其他分子生物学技术6.1 基因表达研究技术6.1.1 基因表达系列分析技术基因表达系列分析技术6.1.2 RNA的选择性剪切技术的选择性剪切技术6.1.3 原位杂交技术原位杂交技术6.1.4 基因定点突变技术基因定点突变技术6.1 基因表达研究技术基因表达研究技术SAGESAGE是以是以DNADNA序列

2、测定为基础定量分析全序列测定为基础定量分析全基因组表达模式的技术。基因组表达模式的技术。任何长度超过任何长度超过9-109-10个碱基的核苷酸片段都个碱基的核苷酸片段都可能代表一种特异性的转录产物，因此，可能代表一种特异性的转录产物，因此，根据某个序列占总标签数的比例可分析所根据某个序列占总标签数的比例可分析所对应基因的表达频率。对应基因的表达频率。 6.1.1 基因表达系列分析技术（基因表达系列分析技术（SAGE）l 常规常规SAGE方法方法 （short SAGE）6.1 基因表达研究技术常规常规SAGE方法方法 （short SAGE）基本基本 流程流程6.1 基因表达研究技术 标签来自

3、转录物标签来自转录物3端一段端一段21bp的序的序列，可列，可 以进行快速分析并与基因组序列以进行快速分析并与基因组序列数据相匹配。数据相匹配。 原理与原理与ShortSAGE方法类似，只是方法类似，只是 用了不同的用了不同的IIS类标签酶（类标签酶（MmeI），并将），并将程序做了相应修改。程序做了相应修改。l LongSAGE技术：技术：6.1 基因表达研究技术 RNA的选择性剪接是指用不同的剪接方式从一的选择性剪接是指用不同的剪接方式从一个个mRNA前体产生不同的前体产生不同的mRNA剪接异构体的过剪接异构体的过程。程。 类型：平衡剪切、类型：平衡剪切、5选择性剪切、选择性剪切、3选择性

4、剪选择性剪切、外显子遗漏型剪切及相切、外显子遗漏型剪切及相 互排斥性剪切。互排斥性剪切。 常用常用RT-PCR法研究某个基因是否存在选择性剪法研究某个基因是否存在选择性剪切。切。6.1.2 RNA的选择性剪接技术的选择性剪接技术6.1 基因表达研究技术选择性剪切的不同类型选择性剪切的不同类型 RT-PCR检测检测5个拟南芥转录个拟南芥转录调控因子基因的选择性剪切调控因子基因的选择性剪切6.1 基因表达研究技术 果蝇果蝇Dscam基因可以通过可变剪接产生基因可以通过可变剪接产生38000多种可能的多种可能的mRNA异构体异构体6.1 基因表达研究技术原位杂交（原位杂交（ISHISH）是用标记的核

5、酸探针，经放射自显影或非）是用标记的核酸探针，经放射自显影或非放射检测体系，在组织、细胞、间期核及染色体上对核酸放射检测体系，在组织、细胞、间期核及染色体上对核酸进行定位和相对定量研究的一种手段。进行定位和相对定量研究的一种手段。分为分为RNARNA和染色体原位杂交两大类。和染色体原位杂交两大类。RNARNA原位杂交用放射性或非放射性（如地高辛、生物素等）原位杂交用放射性或非放射性（如地高辛、生物素等）标记的特异性探针与被固定的组织切片反应，若细胞中存标记的特异性探针与被固定的组织切片反应，若细胞中存在与探针互补的在与探针互补的mRNAmRNA分子，两者杂交产生双链分子，两者杂交产生双链RNA

6、RNA，可通，可通过放射性标记或经酶促免疫显色，对该基因的表达产物做过放射性标记或经酶促免疫显色，对该基因的表达产物做出定性定量分析。出定性定量分析。6.1.3 原位杂交技术原位杂交技术6.1 基因表达研究技术mRNA的互补链，的互补链， 杂 交 信 号 集 中 于杂 交 信 号 集 中 于 纤维细胞中。纤维细胞中。负对照，负对照，mRNA的同义的同义链链, 无杂交无杂交 信号信号正对照，正对照，UBQ10杂交信杂交信号遍布于号遍布于 整个整个胚珠胚珠6.1 基因表达研究技术荧光原位杂交（荧光原位杂交（FISHFISH）首先对寡核苷酸探针做特殊的修饰和标记，首先对寡核苷酸探针做特殊的修饰和标记

7、， 然然后用原位杂交法与靶染色体或后用原位杂交法与靶染色体或DNADNA上特定的序列上特定的序列结合，再通过与荧光素分子相耦联的单克隆抗结合，再通过与荧光素分子相耦联的单克隆抗体来确定该体来确定该DNADNA序列在染色体上的位置。序列在染色体上的位置。6.1 基因表达研究技术通过改变基因特定位点核苷酸序列来改变所编码通过改变基因特定位点核苷酸序列来改变所编码的氨基酸序列，用于研究某个（些）氨基酸残基的氨基酸序列，用于研究某个（些）氨基酸残基对蛋白质的结构、催化活性以及结合配体能力的对蛋白质的结构、催化活性以及结合配体能力的影响，也可用于改造影响，也可用于改造DNADNA调控元件特征序列、修调控

8、元件特征序列、修饰表达载体、引入新的酶切位点等。饰表达载体、引入新的酶切位点等。目前，主要采用两种目前，主要采用两种PCRPCR方法，重叠延伸技术和方法，重叠延伸技术和大引物诱变法，在基因序列中进行定点突变。大引物诱变法，在基因序列中进行定点突变。6.1.4 基因定点突变技术基因定点突变技术6.1 基因表达研究技术 寡核苷酸介寡核苷酸介导的导的DNA突突变技变技 术术6.1 基因表达研究技术重叠延伸介导的定点诱变重叠延伸介导的定点诱变6.1 基因表达研究技术大引物诱变法示意图大引物诱变法示意图6.1 基因表达研究技术6.2. 基因敲除技术（gene knock-out）通过一定的途径使特定的基

9、因失活或缺失的通过一定的途径使特定的基因失活或缺失的技术。通常意义上的基因敲除主要是应用技术。通常意义上的基因敲除主要是应用DNA同源重组原理，用同源片段替代靶基因同源重组原理，用同源片段替代靶基因片段，进行精确的定位修饰和基因改造，同片段，进行精确的定位修饰和基因改造，同染色体一起稳定遗传。染色体一起稳定遗传。6.2.1 基本原理基本原理6.2.2 高等动物基因敲出技术高等动物基因敲出技术6.2.3 植物基因敲出技术植物基因敲出技术6.2 6.2 基因敲除技术基因敲除技术经典遗传学（经典遗传学（Forward geneticsForward genetics）是从一个突变体的表型）是从一个突

10、变体的表型出发，研究其基因型，进而找出该基因的编码序列。出发，研究其基因型，进而找出该基因的编码序列。现代遗传学（现代遗传学（Reverse geneticsReverse genetics，反向遗传学）首先从基，反向遗传学）首先从基因序列出发，推测其表现型，进而推导出该基因的功能。因序列出发，推测其表现型，进而推导出该基因的功能。基因敲除（基因敲除（gene knock-outgene knock-out）又称基因打靶，通过外源）又称基因打靶，通过外源DNADNA与染色体与染色体DNADNA之间的同源重组，进行精确的定点修饰和之间的同源重组，进行精确的定点修饰和基因改造，具有专一性强、染色体

11、基因改造，具有专一性强、染色体DNADNA可与目的片段共同稳可与目的片段共同稳定遗传等特点。定遗传等特点。6.2.1 基本原理基本原理6.2 6.2 基因敲除技术基因敲除技术基因敲除分两种：基因敲除分两种： 完全基因敲除、条件型基因敲除（又称不完全基完全基因敲除、条件型基因敲除（又称不完全基因敲除）。因敲除）。完全基因敲除是指通过同源重组法完全消除细完全基因敲除是指通过同源重组法完全消除细胞或者动物个体中的靶基因活性。胞或者动物个体中的靶基因活性。条件型基因敲除是指通过定位重组系统实现特条件型基因敲除是指通过定位重组系统实现特定时间和空间的基因敲除。定时间和空间的基因敲除。噬菌体噬菌体Cre/

12、Loxp系统、系统、Gin/Gix系统、酵母细胞系统、酵母细胞的的FLP/FRT系统和系统和R/RS系统是现阶段常用的四种系统是现阶段常用的四种定位重组系统，尤以定位重组系统，尤以Cre/Loxp系统应用最为广泛。系统应用最为广泛。6.2 6.2 基因敲除技术基因敲除技术用取代型（用取代型（a）或插入型（）或插入型（b）载体进行完全基因敲除实验）载体进行完全基因敲除实验6.2 6.2 基因敲除技术基因敲除技术正负筛选法（正负筛选法（PNS法）筛选已发生同源重组的细胞法）筛选已发生同源重组的细胞6.2 6.2 基因敲除技术基因敲除技术真核生物基因敲除的技术路线主要包括构建重组基因载体，真核生物基

13、因敲除的技术路线主要包括构建重组基因载体，用电穿孔、显微注射等方法把重组用电穿孔、显微注射等方法把重组DNADNA导入胚胎干细胞纯导入胚胎干细胞纯系中，使外源系中，使外源DNADNA与胚胎干细胞基因组中相应部分发生同与胚胎干细胞基因组中相应部分发生同源重组，将重组载体中的源重组，将重组载体中的DNADNA序列整合到内源基因组中并序列整合到内源基因组中并得以表达。得以表达。显微注射命中率较高，技术难度相对大些。显微注射命中率较高，技术难度相对大些。 电穿孔法命中率比显微注射低，操作使用方便。电穿孔法命中率比显微注射低，操作使用方便。胚胎干细胞（胚胎干细胞（ESES细胞）分离和体外培养的成功奠定了

14、哺乳细胞）分离和体外培养的成功奠定了哺乳动物基因敲除的技术基础。动物基因敲除的技术基础。6.2.2 高等动物基因敲出技术高等动物基因敲出技术6.2 6.2 基因敲除技术基因敲除技术22 模式动物小鼠模式动物小鼠中完全基因敲中完全基因敲除的主要技术除的主要技术策略与应用。策略与应用。6.2 6.2 基因敲除技术基因敲除技术T-DNAT-DNA插入失活技术是目前在植物中使用最为广插入失活技术是目前在植物中使用最为广泛的基因敲除手段。泛的基因敲除手段。利用根癌农杆菌利用根癌农杆菌T-DNAT-DNA介导转化，将一段带有报介导转化，将一段带有报告基因的告基因的DNADNA序列标签整合到基因组序列标签整

15、合到基因组DNADNA上，如上，如 果这段果这段DNADNA插入到目的基因内部或附近，就会影插入到目的基因内部或附近，就会影响该基因的表达，从而使该基因响该基因的表达，从而使该基因“失失 活活”。6.2.3 植物基因敲出技术植物基因敲出技术6.2 6.2 基因敲除技术基因敲除技术植物基因敲除突变体植株筛选植物基因敲除突变体植株筛选 a.引物设计。引物设计。LP和和RP分别分别代表插入基因两端的引物，代表插入基因两端的引物，LB是指载体上的一段是指载体上的一段 引物，引物，目的基因片段目的基因片段(设为设为900bp)。旁邻序列是经测序后获得的旁邻序列是经测序后获得的DNA序列。序列。 b. P

16、CR产物电泳结果。分产物电泳结果。分别代表野生型、杂合子和纯合别代表野生型、杂合子和纯合子子PCR条带。条带。6.2 6.2 基因敲除技术基因敲除技术6.3 6.3 蛋白质蛋白质及RNARNA相互作用技术6.3.1 酵母单杂交系统酵母单杂交系统6.3.2 酵母双杂交系统酵母双杂交系统6.3.3 体外蛋白质相互作用技术体外蛋白质相互作用技术6.3.4 细胞内蛋白质相互作用研究细胞内蛋白质相互作用研究6.3.5 RNAi技术及其应用技术及其应用6.3 蛋白质蛋白质及及RNA相互作用技术相互作用技术 酵母单杂交系统是酵母单杂交系统是2020世纪世纪9090年代中期发展起来的年代中期发展起来的研究研究DNA-DNA-蛋白质之间相互作用的新技术。蛋白质之间相互作用的新技术。 特点：可识别稳定结合于特点：可识别稳定结合于DNADNA上的蛋白质，在酵上的蛋白质，在酵母细胞内研究真核生物中母细胞内研究真核生物中DNA-DNA-蛋白质之间的相互蛋白质之间的相互作用，并通过筛选作用，并通过筛选DNADNA文库直接获得靶序列相互文库直接获得靶序列相互作用蛋白的编码基因。作用蛋白的编码基因。 该体系也是分析鉴