微生物基因工程菌.ppt

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1、基因工程菌2大肠杆菌3被选为基因工程菌的原因常见易得，易于培养质粒为常用运载体代谢迅速, 经济高效基因工程菌的通性基因工程菌的通性4作为表达外源基因受体菌的优劣比较劣势缺乏对真核生物蛋白质的复性功能缺乏对真核生物蛋白质的修饰加工系统内源性蛋白酶降解空间构象不正确的异源蛋白细胞周质内含有种类繁多的内霉素优势基因克隆表达系统完善全基因组测序，共有4405个开放型阅读框架繁殖迅速、培养简单、操作方便、遗传稳定被美国FDA批准为安全的基因工程受体生物工程菌高密度发酵工艺自重组DNA技术产生以来，许多在临床上具有重要治疗价值的蛋白药物通过携带有目的基因的大肠杆菌成功地在实验室和工厂得以生产。利用基因重组

2、技术构建的基因工程菌的发酵工艺不同于传统的发酵工艺，生物工程菌发酵的目的是希望能狄得大量的外源基因产物，尽可能减少宿主细胞本身蛋白的污染。外源基因的高水平表达不仅涉及宿主、载体和目的基因二者之间的相互关系，而且与其所处环境条件息息相关，因此仅按传统的发酵工艺生产生物制品是远远不够的，需要对影响外源基因表达的因素进行分析，探索出适合外源基因表达的发酵工艺。高密度、高产率和高浓度培养是近几年发酵工业的目标和方向。对于大肠杆菌，尤其是重组大肠杆菌的发酵来讲，实现高密度发酵，可相应的缩小生物反应器的体积和降低生物量的分离费用，从而降低生产成本，达到提高生产效率的目的。通过对基因工程菌(RRhPI-pQ

3、E40 E.coli M15)发酵条件的优化，可以看出摇床转速与补料方式对发酵结果影响最大.摇床转速与发酵过程中氧气的供给有很大的关系。大肠杆菌的生长代谢需要氧气的参与，溶解氧浓度对菌体的生长及重组产物的影响很大，溶解氧的浓度过高或过低都会影响大肠杆菌的代谢，使后期生长变得极为缓慢，而且会降低重组蛋白的表达量.菌体在进行大量的增殖过程中，消耗氧进行氧化分解代谢，因而饱和氧的及时供给非常重要。随着发酵的进行菌体的细胞密度迅速增加，溶解氧的浓度因不断被菌体消耗而降低，细胞的生长开始减慢，ST值下降，尤其在发酵后期，下降幅度更大。在高密度发酵后期，由于菌体密度的扩增，耗氧量极大，发酵罐的各项物理参数

4、均不能满足对氧的供给，结果导致外源蛋白的表达量很低。所以维持较高水平的溶氧浓度能提高带有重组质粒的大肠杆菌的生长繁殖，有利于外源基因的重组蛋白的表达。一般的高密度发酵的通风速度达到18L/min ( 20L发酵罐)，搅拌速度达到500rpm以上，往往还需要供给纯氧，需保持60%以上的溶氧饱和度，这样才能提高带有重组质粒细胞的生长，利于外源蛋白产物的形成。需要注意的是，要考虑通风速度和搅拌速度的增加对泡沫的产生和发酵液粘稠度的影响，需要在培养基中加入适宜的消泡剂。6酵母菌7酵母菌在工程菌中的应用单细胞真核生物的酵母菌具有比较完备的基因表达调控机制和对表达产物的加工修饰能力。酿酒酵母（Saccha

5、romyces.Cerevisiae）在分子遗传学方面被人们的认识最早，也是最先作为外源基因表达的酵母宿主。1981年酿酒酵母表达了第一个外源基因-干扰素基因，随后又有一系列外源基因在该系统得到表达干扰素和胰岛素虽然已经利用酿酒酵母大量生产并被广泛应用，当利用酿酒酵母制备时，实验室的结果很令人鼓舞，但由实验室扩展到工业规模时，其产量迅速下降。原因是培养基中维特质粒高拷贝数的选择压力消失质粒变得不稳定，拷贝数下降。拷贝数是高效表达的必备因素，因此拷贝数下降，也直接导致外源基因表达量的下降。同时，实验室用培养基成分复杂且昂贵，当采用工业规模能够接受的培养基时，导致了产量的下降。为克服酿酒酵母的局限

6、，1983年美国Wegner等人最先发展了以甲基营养型酵母（methylotrophic yeast）为代表的第二代酵母表达系统。甲基营养型酵母包括：Pichia、Candida等以Pichia.pastoris（毕赤巴斯德酵母）为宿主的外源基因表达系统近年来发展最为迅速，应用也最为广泛。酵母菌作为基因工程菌的优势1.酵母菌是最成熟的真核生物表达系统2.全基因组测序，基因表达调控机理比较清楚，遗传操作简单3.具有原核生物无法比拟的真核蛋白翻译后加工系统4.大规模发酵历史悠久，技术成熟，工艺简单，成本低廉。5.能将外源基因表达产物分泌到培养基中6.不含有特异性的病毒，不产内毒素9传统酵母转化系统

7、先使纤维素酶基因与表达载体相结合，再将重组体转入酵母细胞内形成转化子，表达目的基因，从而产生纤维素酶蛋白，这是传统酵母转化系统。目前有 2种方法可以使酵母细胞摄取外源 DNA ，即原生质体转化和完整细胞转化。现在采用较多的是完整细胞转化的方法，该方法是1983年发展起来的。此方法虽然要用Li离子处理细胞，但和原生质体转化方法相比，则比较简单，在筛选转化子时，不必进行细胞壁再生，而且Li离子处理完整酵母细胞的转化率比原生质体的高。但必须用聚乙二醇处理转化细胞，否则转化率会大幅度下降。2023-3-242023-3-2411酵母表面展示系统2023-3-24酵母表面展示系统的类型目前，最常见的酵母

8、表面展示表达系统包括: 凝集素展示表达凝集素展示表达和絮凝素絮凝素展示表达展示表达。凝集素展示表达系统是将外源基因与酵母编码凝集素C端编码序列(含GPI锚定信号序列)连接后插入质粒载体的信号肽下游， 融合蛋白诱导表达后， 信号肽引导嵌合蛋白向细胞外分泌， 由于融合蛋白C末端存在含GPI锚定信号的凝集素多肽序列，可将蛋白锚定在酵母细胞壁中，从而将蛋白分子展示表达在酵母细胞表面。絮凝素展示表达系统利用絮凝素基因与外源蛋白融合，并将融合蛋白展露表达在细胞表面，此系统又包括两个子系统: GPI锚定系统和絮凝结构域锚定系统。GPI锚定系统是利用絮凝素Flo1p的C末端含有的GPI信号锚定外源蛋白，此系统

9、与凝集素展示相似; 絮凝结构域锚定系统是利用Flo1p的中间絮凝功能结构域与外源蛋白融合，通过絮凝功能结构域识别酵母细胞壁中的甘露聚糖链并非共价作用诱导细胞粘附、聚集成可逆性絮状物。2023-3-24酵母表面展示与酶技术酶的固定化是指借助物理或者化学方法将酶固定于特殊的相，使得酶与整体流体分开，但是仍然能够进行底物和效应物分子交换并发挥其催化效能的一种技术。与游离酶相比，固定化酶提高了酶的稳定性，并使酶能够反复回收利用。但是，传统的固定化方法也会产生一些不利因素，例如由于增加固定化操作，导致酶固定化过程中的活性收率损失；另外由于固定化操作需用载体，因而增加了载体成本费和固定化操作费用。2023

10、-3-24酵母表面展示与酶技术利用表面展示技术将具有催化活性的酶展示于酵母等微生物细胞表面就形成了全细胞催化剂，与传统的细胞内酶和外分泌酶不同，表面展示的酶以共价或非共价方式固定于细胞外表面，这种独特的空间定位使其相对自由酶而言有许多优良的特性，如温度、有机溶剂稳定性、可多次重复使用等，这些特点与传统的固定化酶技术相似，但无需额外的蛋白纯化和固定的操作，有着良好的应用前景。Katsumi利用凝集素系统将来源于产黄菌属的 OPH 展示于酵母细胞表面，细胞荧光强度测量表明每个细胞表面可以展示 1.410 4 个 OPH 分子，酵母展示系统OPH酶活性较大肠杆菌冰晶核蛋白展示的酶活性更高，为有机磷化

11、合物的脱毒提供了一种有效的生物催化剂。2023-3-24表面展示与酒精发酵传统的酒精发酵是以淀粉质谷物或糖蜜为原料。随着燃料酒精需求的日益增长，以天然纤维素类资源生产酒精的研究也日益受到人们重视。由于纤维素类物质是自然界中一种潜在的可再生资源，对解决未来能源问题有着巨大的潜力，因此，天然纤维素酒精发酵具有重要意义。Fujita 等成功地将三种纤维素水解酶同时展示在酿酒酵母表面，从而构建了能够增效和按顺序降解纤维素的全细胞生物催化剂。2023-3-24酵母表面展示系统与新药筛选 将未知功能的目的基因产物或特定病理过程相关蛋白产物展示在酵母表面，对cDNA 表达文库或突变体库进行筛选，能发现与这些

12、未知功能的基因产物或病理过程相关产物发生相互作用的物质，有助于对未知基因功能的研究，并能发现一些药物作用的新靶点，或筛选到治疗疾病的新药先导化合物。Visintin 等将酵母表面展示技术与酵母双杂交技术相结合，将抗体的scFv 片断连接到转录因子VP16 的激活结构域( AD) 上， 将抗原连接到LexA的结合结构域( DB) 上，以His3和LacZ 为报告基因， 建立抗原抗体相互作用的展示方法。当抗原- 抗体发生相互作用时，AD 和DB 的结合将启动报告基因的表达，可通过营养缺陷培养基进行检测。这种方法从scFv 突变体展示库中将有可能筛选到抗原特异的抗体，为疫苗及抗体类药物的研制提供良好

13、的平台。2023-3-24酵母细胞表面展示与生物吸附环境污染物的生物修复是以酶促降解或生物吸附为基础的，例如微生物对重金属的吸附就包括两种途径: ( 1) 与细胞表面复合物结合，( 2) 逐渐吸收在细胞内进行消化。然而通过胞内消化降解有毒物质必须使细胞内酶，蛋白质或污染物跨越细胞膜这一屏障，比较缓慢及效率低而且不可重复利用利用表面展示技术能较好地解决这一问题，吸附蛋白直接展示在细胞表面，不仅使吸附过程快捷高效还可以利用回复剂如EDTA 对其进行处理使之不断重复利用。苏云金芽孢杆菌2023-3-24苏云金芽孢杆菌杀虫原理产生芽孢时产生伴孢晶体由几种晶体蛋白即-2内毒素组成-2内毒素分为Cry和C

14、yt两类：Cry活体条件下只对双翅目幼虫有毒,离体条件下具广谱性;Cry分为4种,CryI对鳞翅目幼虫有毒, CryII对鳞翅目和双翅目均有毒,CryIII对鞘翅目有毒,CryIV对双翅目有毒。2023-3-2420苏云金芽孢杆菌基因改造作物优点苏云金芽孢杆菌基因改造作物有如下优点：杀虫毒素释放量大，足以杀灭害虫植物产生的毒素不会释放到外界，只有植食害虫才会进食死亡产生毒素可由组织特异性启动子调控抗虫性是依据孟德尔的遗传规律进行稳定遗传毒素基因可装载在叶绿体基因中，因此排除了通过花粉传播的途径2023-3-24天然苏云金芽孢杆菌作为杀虫菌的缺陷苏云金芽孢杆菌存在的杀虫谱窄、持效期短等缺陷。严重

15、影响了苏云金芽孢杆菌的实际应用。但与转基因植物相比，基因重组微生物具有研究快速、生产方便、应用灵活、害虫不易产生抗性等诸多优点。从自然界筛选新的苏云金芽孢杆菌菌株利用分子生物学的技术鉴定和克隆具有新杀虫特性的杀虫晶体蛋白基因利用基因重组结合转移等基因工程的手段构建新的或具有多重杀虫功效的苏云金芽孢杆菌工程菌2023-3-24目前国内外对苏云金芽孢杆菌工程菌的改造主要集中在：扩大杀虫范围增强持效性植物内生性在水体中提高活性改善土壤中的活性提高毒力等23农药真菌24真菌能作为昆虫农药的理论依据真菌是昆虫病原微生物中最大的一个类群，已发现约有1000 种自然条件下全部病死昆虫中约60% 因真菌致病而

16、亡与病毒、细菌通过胃毒杀虫的途径不同, 真菌主要通过昆虫体壁侵染昆虫, 可侵染刺吸式口器的昆虫和处于非取食期的昆虫卵和蛹等真菌侵染和致病机制复杂，害虫难以对真菌制剂产生抗性对病虫害的持续控制作用, 可以形成昆虫间的流行病对哺乳动物毒性低, 对环境的影响小目的基因的构建1.利用病原真菌的毒力基因，例：真菌孢子附着基因，穿透体壁基因等2.利用外源毒力基因，例：蝎毒素基因、苏云金芽胞杆菌毒素基因等3.利用人工设计并合成基因技术瓶颈如何加快鉴定杀虫真菌毒力基因, 获得安全、高效的目的基因缺乏多基因多毒素表达系统如何建立安全的转化子筛选系统, 克服工程菌株的潜在安全性风险如何克服真菌类生物农药杀虫慢、成本高的缺陷