神经生物学方法.ppt

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1、l神神 经经 生生 物物 学学 常常 用用 l形形 态态 学学 研研 究究 方方 法法l1.1.形态学研究方法：形态学研究方法：l1 1）剖查法：病理解剖，组织化学，）剖查法：病理解剖，组织化学，l 荧光免疫荧光免疫l2 2）影象学：）影象学：CTCT， MRIMRI，PETPETl3) 3) 活体示踪：放射免疫，免疫组化，活体示踪：放射免疫，免疫组化，l HRPHRP法，原位杂交法，原位杂交l4 4）共聚焦激光扫描显微镜：）共聚焦激光扫描显微镜：l2.2.生理学方法：生理学方法：l给予刺激（物理、化学、生物），观察反应给予刺激（物理、化学、生物），观察反应（分泌、电变化）（分泌、电变化）l灌

2、流技术灌流技术 ：保持脑片的存活或观察递质和调：保持脑片的存活或观察递质和调质的分泌质的分泌 （脑片灌流、突触小体脑片灌流、突触小体）l推挽灌流技术推挽灌流技术：观察递质和调质的分泌：观察递质和调质的分泌 l免疫探针技术：观察递质和调质的分泌免疫探针技术：观察递质和调质的分泌 l微透析技术微透析技术：观察递质和调质的分泌：观察递质和调质的分泌 l3.3.电生理方法：微电极技术，电生理方法：微电极技术，l 电压钳电压钳, ,膜片钳技术膜片钳技术l组织材料的处理组织材料的处理l1.1.固定固定(fixation) (fixation) l目的：防止组织自溶，保护组织免受微生目的：防止组织自溶，保护

3、组织免受微生 物侵袭，保存组织成份不被破坏丢失，物侵袭，保存组织成份不被破坏丢失， 维持组织结构使之正确的反应生活状态。维持组织结构使之正确的反应生活状态。 固定剂：固定剂：4%4%多聚甲醛（常用）多聚甲醛（常用） 方法：浸泡固方法：浸泡固定，灌注固定定，灌注固定 l2.2.切片切片(section)(section)：石蜡切片，冰冻切片：石蜡切片，冰冻切片l（一）尼氏染色方法（一）尼氏染色方法(Nissl staining)： l 1.1.定义：是用碱性染料染神经组织的一种方法，定义：是用碱性染料染神经组织的一种方法，神经组织中可与碱性染料结合的主要成份是核神经组织中可与碱性染料结合的主要成

4、份是核酸，神经元胞体中有大量核糖核酸，主要以尼酸，神经元胞体中有大量核糖核酸，主要以尼氏小体的形式存在。细胞核中染色质少，故染氏小体的形式存在。细胞核中染色质少，故染色浅，但有明显的核仁。神经胶质细胞的核中色浅，但有明显的核仁。神经胶质细胞的核中染色质较多，着色较深，但胞浆不着色。电镜染色质较多，着色较深，但胞浆不着色。电镜下尼氏小体是许多规则平行排列并相互移动的下尼氏小体是许多规则平行排列并相互移动的粗面内质网以及其间的游离核糖体组成。粗面内质网以及其间的游离核糖体组成。l2.2.用于尼氏染色的常用染料有：用于尼氏染色的常用染料有：l焦油紫（焦油紫（cresyl violetcresyl v

5、iolet）硫堇（硫堇（thioninethionine）甲苯胺蓝甲苯胺蓝 (toluidine blue)(toluidine blue)l焦油紫染色法焦油紫染色法: :石蜡切片或石蜡切片或冰冰冻切片冻切片0.1%0.1%焦油紫染液焦油紫染液375-10min 375-10min 蒸馏水洗蒸馏水洗 70%Alc 70%Alc 3min 3min 95%Alc 3min 95%Alc 3min 100%Alc 100%Alc 1min1min3 3次次二甲苯二甲苯5min 5min 2 2次次封片。封片。结果结果: :尼氏小体紫色，本底无色。尼氏小体紫色，本底无色。 lDLGlDRGDLGDR

6、GCresyl violet staining Thionine staining Cresyl violet staining l高尔基技术高尔基技术(Golgi technique)(Golgi technique)l The Golgi (and related) methods The Golgi (and related) methods work by staining tissue with silver work by staining tissue with silver nitrate which is then reduced to nitrate which is th

7、en reduced to silver. This produces uniform dark silver. This produces uniform dark coloring of the whole neuron . The coloring of the whole neuron . The morphology of dendrites and axon morphology of dendrites and axon can be studied in detail.can be studied in detail.Cerebellum cortex neuron l神经束路

8、示踪神经束路示踪l利用轴浆运输现象追踪神经元之间联系利用轴浆运输现象追踪神经元之间联系的一种方法。的一种方法。 示踪剂：示踪剂：HRPHRP（horse horse radish peroxidaseradish peroxidase，辣根过氧化物酶），辣根过氧化物酶），快蓝（快蓝（fast bluefast blue），荧光金），荧光金（fluorogoldfluorogold），核黄（），核黄（nuclear nuclear yellowyellow），神经生物素（），神经生物素（neurobiotinneurobiotin），），生物素化葡聚糖胺（生物素化葡聚糖胺（biotinylate

9、d biotinylated dextran amine,BDAdextran amine,BDA）l1 1，HRPHRP的引入：压力注射法，电泳法，缓释法的引入：压力注射法，电泳法，缓释法 l2 2，Survial timeSurvial time：（束路长度：（束路长度 毫米毫米/350/350毫米）毫米）+1+1日日 l3 3，Fixation and Section Fixation and Section l4 4，Incubation Procedure: Incubation Procedure: l a,wash sections briefly in three a,wash

10、 sections briefly in three changes of PB changes of PB l b,move the sections to the incubating b,move the sections to the incubating medium (0.2%DAB,1%Hmedium (0.2%DAB,1%H2 2O O2 2) kept at room ) kept at room temperature for 30-40min. temperature for 30-40min. l c,wash three times in PB for stop th

11、e c,wash three times in PB for stop the reaction. reaction. l d,mounting and observation. d,mounting and observation.HRP labelling neurons in oculomotor nucleus of cat 10 40HRP labellingneurons in dLGN X40Double-labelling of HRP and Glutamate in rat lateral geniculate nucleus l荧光染料示踪法荧光染料示踪法l1，荧光染料的

12、配制：，荧光染料的配制： l2，荧光染料的注射：，荧光染料的注射： l3，动物存活期：一般存活，动物存活期：一般存活2-4天。天。 l4，灌注固定、取材、冰冻切片。，灌注固定、取材、冰冻切片。 l5，贴片后荧光显微镜观察：荧光容易褪，贴片后荧光显微镜观察：荧光容易褪 色，贴片后应立即观察。色，贴片后应立即观察。 Fast blue labelling neuronsDRGSpinal cordlFast Blue l Ladelling lGanglion lCells of lRetina lNO(nitric oxide)NO(nitric oxide)的生物合成：的生物合成： l催化催化

13、NONO生物合成的酶称一氧化氮合酶（生物合成的酶称一氧化氮合酶（NO NO synthase, NOS), NOSsynthase, NOS), NOS以以L-L-精氨酸（精氨酸（L-arg)L-arg)和分子氧为底物，消耗和分子氧为底物，消耗1.5mol NADPH1.5mol NADPH和和2mol2mol分分子氧生成子氧生成NONO和和L-L-瓜氨酸。瓜氨酸。 lNADPH:nicotinamide adenin dinucleotide NADPH:nicotinamide adenin dinucleotide phosphate phosphate lDiaphorase:Diap

14、horase:黄递酶黄递酶 l在神经系统大部分区域在神经系统大部分区域NADPH-dNADPH-d组织化学染色组织化学染色和和NOSNOS免疫组织化学染色一致。免疫组织化学染色一致。 lNOSNOS与与 NADPH-dNADPH-d活性的比较活性的比较lNosNos活性：活性：a.a.协同因子有协同因子有Ca2+Ca2+、CaMCaM、NADPHNADPH阻断任何一个协同因子结合位点都阻断任何一个协同因子结合位点都可抑制可抑制Nos Nos lb.b.底物底物:L-Arg :L-Arg lNADPH-dNADPH-d活性活性:a:a:不需不需CaMCaM、Ca2+Ca2+作为协同作为协同因子，

15、只需因子，只需NADPH NADPH lb b；底物：；底物：NBT(NBT(亚硝基四唑氮蓝）亚硝基四唑氮蓝）lNOSNOS活性活性NADPH-dNADPH-d活性活性, ,使用使用NOSNOS抑制剂抑制剂后不能用后不能用NADPH-dNADPH-d组化染色来分析组化染色来分析NOSNOS活活性。性。NADPH-dNADPH-d组化染色阳性细胞中可含有组化染色阳性细胞中可含有NOS,NOS,但不能说明有但不能说明有NOS NOS 活性，活性，NADPH-dNADPH-d组化染色阴性细胞中一般不含组化染色阴性细胞中一般不含NOS.NOS.la:a:冰冻切片冰冻切片b:0.05M Trisb:0.

16、05M Tris缓冲液漂洗缓冲液漂洗c:c:于含于含0.2%Tritonox-1000.2%Tritonox-100的的TrisTris缓冲液缓冲液中室温下预孵育中室温下预孵育5 510min.10min.d:d:在含在含0.3%Tritonx-0.3%Tritonx-100,1mg/mlNADPH,0.5mg/mlNBT100,1mg/mlNADPH,0.5mg/mlNBT的的TrisTris缓冲液中缓冲液中3737孵育孵育1 11.51.5小时小时. . le:Trise:Tris缓冲液漂洗，中止反应。缓冲液漂洗，中止反应。NADPH-d Staining In NADPH-d Staining In Caudate Nucleus X40 NADPHl利用特异性抗体对神经组织中某种特异利用特异性抗体对神经组织中某种特异成份成份( (抗原抗原) )进行抗原进行抗原-抗体反应抗体反应, ,达到检达到检测组织细胞内是否有此特异性物质。其测组织细胞内是否有此特异性物质。其本质就是用标记的抗体追踪抗原本质就是用标记的抗体追踪抗原( (以确定以确定组织细胞内的某种化学物质组织细胞内的某种化学