第七章现代生物学.ppt
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1、第七章第七章 现代生物学技术在蛋现代生物学技术在蛋白质工程中的应用白质工程中的应用 传统技术:传统技术:分离纯化技术,如层析技术、电泳分离纯化技术,如层析技术、电泳技术;蛋白质鉴定技术,如免疫印迹技术;蛋白质鉴定技术,如免疫印迹 技术、技术、酶联免疫吸附测定(酶联免疫吸附测定(ELISA)新技术:新技术:对蛋白质进行分析鉴定的蛋白质芯片对蛋白质进行分析鉴定的蛋白质芯片技术、蛋白指纹图谱技术;用于功能蛋白质筛技术、蛋白指纹图谱技术;用于功能蛋白质筛选的表面展示技术选的表面展示技术 第一节第一节 表面展示技术表面展示技术 运用运用 DNA 重组技术在重组技术在噬菌体、细菌、真菌、噬菌体、细菌、真菌
2、、病毒病毒等微生物表面呈现外源蛋白或多肽,已等微生物表面呈现外源蛋白或多肽,已在在微生物学、分子生物学、疫苗学和生物技微生物学、分子生物学、疫苗学和生物技术术等方面得到了广泛应用。等方面得到了广泛应用。概念概念 表面展示技术是利用表面展示技术是利用基因工程基因工程手段将手段将外外源基因源基因或一组一定长度的随机寡核苷酸或一组一定长度的随机寡核苷酸片段克隆到特定的表达载体中,使其表片段克隆到特定的表达载体中,使其表达产物与达产物与外膜蛋白或噬菌体外壳蛋白外膜蛋白或噬菌体外壳蛋白以以融合蛋白融合蛋白的形式呈现在细胞表面或噬菌的形式呈现在细胞表面或噬菌体表面。体表面。 一、一、噬菌体展示技术噬菌体展
3、示技术 噬菌体展示技术噬菌体展示技术(phage display techniques,PDT)是将外源肽或蛋白质与特是将外源肽或蛋白质与特定噬菌体衣壳蛋白融合并定噬菌体衣壳蛋白融合并展示于噬菌体表面的技术展示于噬菌体表面的技术(如右图所示)。(如右图所示)。1985 年年 Smith 等首次应用了该等首次应用了该技术。技术。 1988年Parmley和Smith将B-Gal表达于噬菌体的表面,并证实该蛋白有生物活性,可以被相应的抗体识别。随后,许多有功能的蛋白都被表达于噬菌体的表面,包括分泌性蛋白(如抗体、生长激素)、细胞内蛋白和酶类,为这些蛋白的基因工程改造奠定了基础。 从理论上讲,任何蛋
4、白只要能够分泌到细菌周质腔均可被表达于噬菌体的表面。 1990年,George等证明噬菌体不会因外源性DNA片段的插入而影响其本身的粘附、侵入及整合。这种带有外源性基因片段的噬菌体感染宿主菌表达出外源性基因产物和PIII的融合体融合壳蛋白,由于PIII的特殊定位,外源性片段得以在噬菌体表面表达,并同时保持了本身的三维结构和功能,进而使噬菌体成为一个理想的携带工具。Phage structure:Fiber structure 1 原理原理 具体来讲噬菌体展示技术就是将具体来讲噬菌体展示技术就是将待筛选待筛选基因基因插入噬菌体插入噬菌体信号肽序列信号肽序列与与主要衣壳主要衣壳蛋白基因(主要是基因
5、蛋白基因(主要是基因或基因或基因)之之间,构成融合蛋白噬菌体库。表达的间,构成融合蛋白噬菌体库。表达的融融合蛋白合蛋白可以呈现在噬菌体表面,但不影可以呈现在噬菌体表面,但不影响噬菌体的响噬菌体的完整性和活性。完整性和活性。 噬菌体展示载体噬菌体展示载体pCANTAB5E示意图示意图pCANTAB 5E-scFv5243 bpg3 signalsfiIscFvNotIE-tagAmber stopfd gene3M13 oriAp噬菌体展示技术是第一个真正用于体外高噬菌体展示技术是第一个真正用于体外高通量筛选的方法。通量筛选的方法。其建立基于三个原则:其建立基于三个原则:I.在在衣壳蛋白基因衣壳
6、蛋白基因(主要是(主要是基因基因或基因或基因)的)的 N 端端插入外源基因,形成的融合蛋插入外源基因,形成的融合蛋白表达在噬菌体颗粒的表面,不影响也不白表达在噬菌体颗粒的表面,不影响也不干扰噬菌体的生活周期,同时保持了干扰噬菌体的生活周期,同时保持了外源外源蛋白的天然构象蛋白的天然构象,并能被,并能被相应的抗体或受相应的抗体或受体体所识别所识别 。II.利用固定于利用固定于固相支持物固相支持物的的靶分子靶分子,采用适,采用适当的筛选方法,洗去非特异结合的噬菌体,当的筛选方法,洗去非特异结合的噬菌体,筛选出目的噬菌体;筛选出目的噬菌体; III. 外源多肽或蛋白质外源多肽或蛋白质表达在噬菌体的表
7、面,表达在噬菌体的表面,而其编码基因作为病毒基因组中的一部分而其编码基因作为病毒基因组中的一部分可通过可通过分泌型噬菌体分泌型噬菌体的的单链单链DNA测序测序推导推导出来。出来。展示文库的特点展示文库的特点 富集程度高,由此建立的展示文库的可达106-1012 位置明确,噬菌体的PIII蛋白定位特殊,定位于噬菌体的尾部,其氨基末端为噬菌体结合F纤毛 噬菌体的衣壳蛋白有很大的可塑性 大部分的蛋白质都可在其表面表达 目前,能用于蛋白质、多肽展示的噬菌体系目前,能用于蛋白质、多肽展示的噬菌体系统有:统有:丝状噬菌体丝状噬菌体展示系统展示系统 噬菌体噬菌体展示系统展示系统 T4 噬菌体噬菌体展示系统展
8、示系统 T7 噬菌体噬菌体展示系统展示系统 其中,其中,T7 噬菌体噬菌体系统可以系统可以高、中、低高、中、低拷贝展拷贝展示示不同分子量的蛋白不同分子量的蛋白,是目前最为理想的展,是目前最为理想的展示系统。示系统。 单链丝状噬菌体展示系统 P III 展示系统,主要用于获得高亲和力的克隆,形成单价表面展示体系 P VIII 展示系统,主要用于筛选亲和力较低的克隆,形成多价表面展示体系 P VI 展示系统 T4噬菌体展示系统 其病毒颗粒在宿主细胞内组装,不经过分泌途径,因而其表面展示多肽的范围更广,尤其适用于研究那些不能被大肠杆菌分泌的复杂蛋白质 噬菌体展示系统(同上)可展示有活性的大分子蛋白(
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