传统发酵东北酸菜中植物乳杆菌HUCM115的分离及益生特性 附植物乳杆菌JLA-9产细菌素的分离纯化.docx

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1、东北酸菜是我国东北地区人们以贮藏秋菜而在漫长冬季仍能摄取蔬菜为目 的的产物之一，并已成为东北地区重要的一种特色传统发酵食品，可生熟两吃。 传统东北酸菜主要以白菜为原料进行自然发酵，以口感酸爽、脆嫩，风味独特， 富含多种氨基酸等特点于一身而闻名，这与酸菜在自然发酵制备过程中微生物的 组成及作用息息相关。酸菜的菌相组成主要源于附着在蔬菜表面的天然本土微生 物，其与地域环境有关，因此东北地区的气候及环境条件赋予了东北酸菜特有的 风味及营养价值。传统发酵酸菜的微生物菌群涵盖了细菌和真菌两大类，且以细菌占绝对优 势，而细菌中又以乳酸菌为优势菌，主要包括乳杆菌属、明串珠菌属等。乳酸菌 作为益生菌的重要来源

2、而备受关注，并成为研究热点。大量动物及人体临床研究 表明，乳酸菌具有诸多明确的益生功能，如可降胆固醇、抗糖尿病、抗肥胖、抗 抑郁、抗氧化、可降解草酸盐防治肾脏疾病等，这些益生特性具有菌种和菌株特 异性。因此，从传统自然发酵酸菜中分离筛选性状优良的具有潜在应用价值的乳酸 菌具有重要意义。从东北酸菜中分离筛选到1株乳酸菌，通过形态学及基因序 列比对分析对其种属进行鉴定，并探究其益生特性，旨在为益生菌产品的开发及 工业潜在发酵剂菌种筛选提供理论支持。1菌株的分离与鉴定1.1 I菌株的分离采集的传统自然发酵酸菜样品经mMRS选择性培养基分离筛选，共分离到 可在含0.75% CaCO3的mMRS固体培养

3、基上形成透明圈菌落、革兰氏阳性且过 氧化氢酶阴性的疑似乳酸菌9株，分离结果如图1所示。生长速度是筛选工业 发酵剂菌种的重要指标之一，故选取了其中1株在液体培养基中生长速度最快 的菌株HUCMl 15进行深入研究。1.2 I形态学特征菌株HUCMl 15在mMRS固体培养基和液体培养基分别于37 C培养24 h, 其生长情况及革兰氏染色观察菌体细胞的形态特征如图2所示。菌株HUCMIl5 在mMRS琼脂培养基上形成为圆形，表面光滑有光泽，边缘完整，低凸，质地 黏稠，乳白色，菌落不透明；菌体细胞为短杆，两端钝圆，单在、成对排列，偶 见成链；液体培养24 h呈混浊生长，但上层较澄清，底部有厚层沉淀，

4、上下层 界限明显。1.3 U6 SrDNA序列比对分析菌株HUCMlI5的16SrDNA基因经PCR扩增、纯化并测序，M 16SrDNA 基因序列经BLAST后发现与乳杆菌属内菌种的同源性最高。利用MEGA5.1软 件,与GenBank数据库中己知的乳杆菌属内模式菌株的16S rDNA基因序列进行 序列比较，并以非同属的ESCherChiaCoIi模式菌株为外标，绘制出系统发育树， 结果如图3所示。由图 3 可知，菌株 HUCMl 15 与 Lactobacillus plantarum 和 L.pentosus 模式株 的亲缘关系最近，序列相似性均大于98%,故通过16SrDNA基因序列比对

5、分析 尚无法确定菌株HUCMlI5的具体种。因此，选择PheS基因序列进一步比对分 析。1.4 I PheS基因序列比对分析为了进一步确定菌株HUCMl 15种的归属，其pheS基因被进一步扩增及测 序，经BLAST后发现其pheS基因序列同样与乳杆菌属内菌种的同源性最高。 同样利用MEGA5.1软件，以非同属的HenCobaCterPylOri模式菌株为外标，与已 知的乳杆菌属内模式菌株的PheS基因序列进行比较分析，绘制系统发育树，结 果如图4所示。基于PheS基因序列构建的系统发育树显示，菌株HUCMIl5与 Lpkmtarum模式株的亲缘关系最近，且序列相似性为100%。因此，鉴于形态

6、学 特征及16S rDNA和pheS基因序列比对分析结果，可确定HUCMl 15菌株为植 物乳杆菌。2菌株HUCMu5的酸耐受性菌株HUCMIU5分别在pH 2.0、2.5和pH 3.0环境下37 培养3 h,不同 培养时间活菌数变化情况如图5所示。在PH 3.0和PH 2.5酸性环境下保持3 h 前后活菌数无显著变化(P0.05),仍维持在109CFUmL水平；pH 2.0酸性环 境对菌株HUCMl 15的存活影响较大，培养1 h后活菌数从1.9109 CFUZmL降 为8.4x107 CFUmL,而培养2 h后则无活菌检出。3菌株HUCMIl5的胆汁耐受性如图6所示，不论在0.3 g/10

7、0 mL还是0.5 g/100 mL胆汁环境下，菌株 HUCMu5培养1、2、3h后活菌数与Oh相比均无显著差异(P0.05),这说明 菌株HUCMl 15处于胆汁质量浓度低于0.5 g/100 mL环境时，其菌种活力不会受 到任何影响。4菌株HUCMil5的自动聚集能力结果显示，植物乳杆菌HUCMU5培养物经振荡后发生了迅速沉降，室温静 置30 min自动聚集百分比为15.4%,而静置60 min则达到近70%,此时细菌悬 浮液上层溶液呈澄清状态，之后自动聚集百分比则趋于平稳无显著变化，到第 150分钟时自动聚集百分比为72.4%o5菌株HUCMu5体外去除胆固醇作用未接种与接种植物乳杆菌H

8、UCM115的含胆固醇培养基于37 培养24 h 后，分别测定培养上清液的胆固醇含量，结果显示，植物乳杆菌HUCMll5培养 在含胆固醇培养基中24 h后，培养基中20.6%胆固醇被去除，说明该菌株具有潜 在的降胆固醇特性。6菌株HUCMl 15产GABA的能力在富含谷氨酸的培养基中，接种菌株HUCMll5培养48 h后，用高效液相 色谱法检测发酵液中GABA含量，色谱如图8所示。利用外标法以峰面积进行 定量可知,植物乳杆菌HUCMII5于37 C培养在含1%谷氨酸的TYG培养基中， 孵育48 h后发酵液中GABA质量浓度可达(101.30.8) gmL,结论从东北酸菜中分离到1株植物乳杆菌H

9、UCM115,具有良好的酸和胆汁耐受 性及自动聚集能力，37 C发酵24 h后培养基中胆固醇去除率可达20.6%,发酵 48h后GABA质量浓度可积累至101.3gmL,展现出了优良的益生特性，具有 潜在的应用价值。植物乳杆菌JLA-9产细菌素的分离纯化摘要：将来源于东北传统发酵酸菜中的植物乳杆菌JLA-9产的细菌素进行 分离纯化，首先利用饱和度为80%的硫酸镀溶液对发酵上清液进行沉淀粗分离。 复溶后利用Sephadex LH-20进行凝胶层析纯化，之后采用Hitrap QFF进一步进 行离子交换层析纯化，利用反相高效液相色谱(ReVerSed-PhaSe High Performance L

10、iquid Chromatography, RP-HPLC)C18柱进行最终纯化,得到单一活性抑菌组分， 说明细菌素得到基本纯化，经基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱 (Matrix-Assisted Laser Desorption/ Ionization Time of Flight Mass SPeCgmetry,MALDI-TOF/MS)确定该细菌素的分子质量约为0.9 kDa左右。采用 琼脂扩散法测定了细菌素对常见的食源性致病菌和腐败菌的抑菌效果，结果显示 该细菌素具有较好的抑制作用。关键词：植物乳杆菌；细菌素；分离；纯化；分子质量植物乳杆菌作为一种重要的乳酸菌，目前已经被广泛的应用到

11、食品加工相关 领域中1。许多植物乳杆菌能够产生细菌素，且细菌素具有热稳定性高，耐酸， 抑菌谱广以及能够被蛋白酶降解等优点，已经成为食品行业生物防腐剂开发的一 个热门方向2-3。目前从发酵食品中已经获得多种植物乳杆菌产的细菌素，例如 plantaricin 163(4, plantaricin A-I 5, plantaricin 35d6, bacteriocin AMA-K7, plantaricin MG8以及plantaricin ZJ59等。有的植物乳杆菌产的细菌素抑菌谱较 广，对革兰氏阳性菌和阴性菌都具有抑制效果，如分离自泡菜中的植物乳杆菌 163产的细菌素PlantariCin 1

12、63对食品中常见的大肠杆菌，金黄色葡萄球菌，蜡 样芽抱杆菌等均具有较好的抑菌作用41。但有的细菌素抑菌谱却很窄，仅能抑 制少数种类的细菌，例如从山羊奶中分离获得的植物乳杆菌LC74产的细菌素 plantaricin LC74,仅能够抑制植物乳杆菌，短乳杆菌和布氏乳杆菌10。细菌素的分离纯化主要是根据细菌素的带电性、分子质量大小及疏水性等特 点来进行。一般的纯化主要包括3个基本的步骤：即粗提取、初步纯化和精细纯 化。粗提取大部分都是采用盐析的方法，主要是在发酵上清液中加入无机盐，最 常用的是硫酸镀，使蛋白类细菌素的溶解度降低从而从液体中析出。S0UMAYA 等利用盐析的方法从唾液乳杆菌SMXD5

13、1的发酵液中对细菌素进行粗分离，取 得了很好的效果，回收率为1.36%lllo RAMAKRlSHNAN等利用硫酸铉沉淀粗 分离鼠李糖乳杆菌L34产的细菌素，得到了较好的分离效果12。也有少部分人 选用有机溶剂进行萃取，主要是利用细菌素在互不相溶或者微溶的发酵上清液和 有机溶剂中溶解度的不同，从而使细菌素从发酵上清液中转移到有机溶剂中，然 后将有机溶剂通过真空旋转浓缩除去，最后得到粗提的细菌素，如TAYLOR等 利用甲醇和乙醇提取nisin取得了较好的分离效果13。初步纯化一般主要目的 是除去大部分的杂质，使细菌素的纯度达到50%90%,用于进一步的纯化鉴定， 通常采用离子交换层析和凝胶层析等

14、方式进行纯化。由于乳酸菌产的细菌素一般 所带的电荷大小不同，因此选用离子交换层析能够达到对细菌素分离纯化的目 的，该方法具有操作简单及交换容量大等特点，已经成为细菌素纯化过程中的最 常用的方法之一。ZHU等利用离子交换层析结合凝胶层析的方法，以0.15molL NaCl进行洗脱分离得到植物乳杆菌ZJ008产的细菌素plantaricin ZJ008,纯化 倍数达到24.814. HATA等采用离子交换和凝胶层析对植物乳杆菌A-I产的细 菌素PIantariCinASMl进行分离，纯化倍数达到20倍15。一般精细纯化作为整 个纯化的最后一步，目的是除去样品中残留的痕量杂质，是样品中的纯度高于 9

15、9%,以便于采用质谱和氨基酸测序等手段对其结构进行鉴定。目前大部分纯化 实验的最后一步都是采用反相高效液相色谱法，它可以显著地提高样品的纯度， 因此反相高效液相色谱技术已经在细菌素纯化中得到了广泛的应用14-16。本课题组前期从东北传统发酵酸菜中分离得到1株植物乳杆菌JLA-9,对革 兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均具有较强的抑制作用。本研究拟选用硫酸钱沉淀， 凝胶柱层析，离子交换层析和反相高效液相色谱等分离纯化手段对植物乳杆菌 JLA-9产的细菌素进行分离纯化，为深入研究其结构及性质提供理论依据。植物乳杆菌JLA-9,本实验室分离自农家自制发酵酸菜，现己保存于中国普 通微生物菌种保藏管理中心(CG

16、MCC No. 10686)o指示菌菌株及来源：大肠杆菌(ArCC25922)、蜡样芽狗杆菌(ASLI846)、荧 光假单胞菌(AS1.1802)、藤黄微球菌(CMCC(B)2800)、枯草芽抱杆菌(ATCC9943) 和肠炎沙门氏菌(CICC21527)。MRS培养基：牛肉膏IOg,蛋白陈IOg,乙酸钠5g, K2HPO42 g,柠檬酸 氢钱 2 g, MgSO47H2O 0.58 g, MnSO44H2O0.25 g,葡萄糖 20 g,吐温-80 1 mL, 蒸储水IL, pH6.26.4, 115、20 Inin灭菌备用,固体培养基另加1.5%2% 的琼脂。LB培养基：酵母粉5 g,蛋白陈10g, NaC15 g,蒸储水1 L, pH 7.0, 121 20min灭菌备用，固体培养基另加1.5%2%的琼脂。Sephadex LH-20,