维生素B1含量试剂盒说明书HPLC法50管48样.docx

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1、维生素Bl含量试剂盒说明书HPLC法50管/48样测定意义：维生素是人和动物为维持正常的生理功能而必须从食物中获得的一类微量有机物质，在人和动物生长、代谢、发育过程中发挥着重要的作用。维生素大致可分为脂溶性和水溶性两大类，水溶性维生素主要包括维生素C和B族维生素。维生素Bl又叫硫胺素（Thiamine）,可保持神经机能正常，促进糖代谢，保障脑的正常功能，防止精神疲劳和倦怠，预防心脑疾病，被称为“心脏与神经的维生素二测定原理：维生素BI在210nm下有吸收峰，可以利用高效液相色谱法测定其含量。需自备的实验用品：高效液相色谱仪、低速离心机、溶剂抽滤装置、氮吹仪、涡旋振荡器、针头式过滤器（有机系，5

2、0个，0.22m）滤膜（水系和有机系各1个，0.45mM耐水C18柱（4.6x250mm）、可调式移液器、样品瓶（50个，2mL）、内衬管（50个，放置在样品瓶内用于微量样品进样）、乙月青（色谱级，10OmL）和超纯水。试剂的组成和配制：试剂一：液体IOOmLXl瓶，4保存（提取液）；试剂二：维生素BI标准品0.5mgxl支，-20C保存。实验前的准备工作：1、将超纯水IOOOmL和乙晴IOOmL用0.45m的滤膜抽滤，以除去溶剂中的杂质，防止堵塞色谱柱。（注：蒸储水用水系滤膜抽滤，甲醇用有机系滤膜抽滤）。2、流动相A：0.05molL磷酸二氢钾缓冲溶液（含0.2%三乙胺，pH6.0）-乙月青

3、（97:3）,即970mL水+66g磷酸二氧钾+1.94mL三乙胺+3OmL三乙胺；流动相B：甲醇。A和B比例为90:IOo3、将配好的流动相超声30分钟，以脱去溶剂中的气泡，防止堵塞色谱柱。维生素Bl的提取：称取约0.1g样本，加入ImL试剂一,冰浴匀浆,冰水浴超声30min。8000g离心IOmin,取上清液，针头式过滤器过滤后待测。操作过程注意低温、避光。标准品的配制：在试剂二中加入ImL试剂一，配成500gZmL母液，将母液用试剂一分别稀释成40gg/mL、30gmL20gmL和10g/mL的维生素Bl标准品溶液。针头式过滤器过滤后待测。维生素Bl含量测定操作步骤：1 .开启电脑、检测

4、器和泵，安装上色谱柱，打开软件，在方法组中设置进样量10L,流速0.8mLmin,柱温25,保留时间IOmin,检测波长210nm,设置完毕保存方法组。2 .用流动相过柱子，待基线稳定后开始加样。3 .加入标准品IOL,在Iomin内可分离维生素BI,维生素Bl的保留时间在4.8min左右,（柱子不同，保留时间有差异），计算不同浓度的维生素Bl标准品的峰面积。4 .加入样品10L,在相应保留时间处检测维生素Bl的峰面积。维生素Bl含量的计算：以标准品浓度（gmL）为横坐标，峰面积为纵坐标计算维生素Bl标准曲线。将样品峰面积代入标准曲线，计算样品维生素Bl含量。注意事项：1、整个操作过程应注意低温、避光。2、为了避免使用过程中柱压过大，流速由小到大调节。3、标准品的稀释倍数要根据样品中维生素Bl浓度确定,样品中维生素Bl的峰面积必须落在不同浓度的维生素Bl标准品的峰面积之内，该标准品稀释倍数只是一个参考。