实验室细胞培养基本知识.pptx
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1、细胞培养基本知识细胞培养基本知识细胞培养基本概念细胞培养基本概念细胞培养:细胞培养:从动物或植物中取出细胞,使其在合适的人工环境中生长。细胞来源:细胞来源:细胞可直接从组织中取出并采用酶或机械方法进行解离,也可来自已经建立的细胞系或细胞株。原代培养:原代培养:是指将细胞从组织中分离后,使其在合适的条件下增殖,直到占据所有可用基质(即:汇合) 的培养阶段。传代培养:传代培养:在细胞生长至汇合,必须将细胞转移到新的容器中并更换新鲜培养基,为其提供更多继续生长的空间。细胞系:细胞系:首次传代培养后,原代培养物即被称为细胞系。细胞株:细胞株:如果将细胞系的一个细胞通过克隆或者其他方法从培养物中明确地选
2、择出来,就成为一个细胞株。有限细胞系与连续细胞系:有限细胞系与连续细胞系:正常细胞通常只能分裂有限的次数,随后就会丧失增殖的能力,这是一个由遗传决定的事件,被称为衰老;这种只能分裂有限的次数的细胞系被称为有限细胞系有限细胞系。但是,一些细胞系会通过“转化”的过程变为永生性细胞系,这一过程可自然发生,也可经化学或病毒诱导发生。有限细胞系发生转化获得无限分裂能力后,就成为连续细胞系连续细胞系。培养条件:培养条件:细胞培养的人工环境必须包括合适的容器,容器中含有一定的基质或介质,为细胞提供必需的营养素 (氨基酸、碳水化合物、维生素、矿物质)、生长因子、激素和气体 (O2、CO2),并可调节其物理化学
3、环境 (pH、渗透压、温度)。细胞培养基本概念细胞培养基本概念为什么要细胞培养?为什么要细胞培养?避开机体自身调节和实验应激的整体因素的影响;环境控制、均一性(可以使用一批同源细胞获得稳定、可重复的结果)、经济、规模和机械化;细胞培养的应用细胞培养的应用细胞培养是细胞和分子生物学中最重要的一项技术最重要的一项技术,可为细胞正常生理和生化 (例如:代谢研究、衰老研究)、药物和毒性化合物对细胞的作用以及致突变和致癌研究提供上佳的模型系统。细胞培养还可用于药物筛选和开发以及生物化合物 (例如:疫苗、治疗性蛋白) 的大规模生产。细胞培养实验室细胞培养实验室一更一更二更二更一间一间二间二间三间三间走廊走
4、廊隔间隔间准备室准备室细胞培养设备细胞培养设备基本设备:基本设备:细胞培养通风橱 (即:层流通风橱或生物安全柜)培养箱 (推荐使用湿式二氧化碳培养箱)水浴锅离心机冰箱和冰柜 (20C)细胞计数器 (例如:Countess 自动细胞计数器或血球计数器)倒置显微镜液氮 (N2) 冷冻柜或冻存容器灭菌器 (即:高压灭菌器)扩增设备:扩增设备:抽吸泵 (蠕动泵或真空泵)pH 计共聚焦显微镜流式细胞仪其他用品:其他用品:细胞培养容器 (例如:培养瓶、培养皿、滚瓶、多孔板)吸管和移液器注射器和针头废物容器培养基、血清和试剂细胞系细胞培养通风橱通过维持工作区域上方稳定、单向的HEPA过滤空气流动,保护工作环
5、境免受灰尘及其他空气污染物污染。气流可以呈水平方向,与工作台面平行吹过,或者也可呈垂直方向,从通风橱上方吹向工作台面。准备与灭菌准备与灭菌灭菌方式的选择灭菌方式的选择 热稳定的物品(玻璃器皿、金属)用干热灭菌:160,1h; 热稳定的液体:水、盐溶液和适度热稳定的塑料制品:硅树脂、尼龙、聚丙烯、聚碳酸酯用湿热灭菌:121,20min; 不耐热液体:过滤除菌; 不耐热物品:射线灭菌30min,70%乙醇擦拭。灭菌方式的选择灭菌方式的选择项目项目消毒方式消毒方式玻璃器皿干热金属制品干热带螺口盖的玻璃品高压灭菌,将盖悬松玻璃移液管干热枪头高压灭菌离心管(5ml,15ml,50ml)高压灭菌,直立放置
6、EP管(1.5ml,2ml,5ml,10ml)高压灭菌试管干热艾本德移液器(新) 高压灭菌,整支高压灭菌高压灭菌过滤过滤琼脂氨基酸蛋白胨抗生素EDTA牛血清白蛋白甘油胶原酶HEPES药物甲基纤维素谷氨酸盐酚红生长因子盐溶液HCL水NaHCO3NaOH血清丙酮酸钠胰蛋白酶玻璃器皿、金属器皿的清洗和灭菌玻璃器皿、金属器皿的清洗和灭菌将玻璃和金属器皿放入含有消毒剂(次氯酸钠)和清洁剂(Decon)的洗液中,侵泡过夜或至少2h(铝、铜制品不得浸泡);试管刷清洗,自来水冲洗4次,去离子水冲洗3次;倒置于烘箱中烘干;铝箔封口保存;使用前2448h,放入干热灭菌箱中,160灭菌1h,自然冷却后使用;100目
7、和600目的筛网需要超声清洗。塑料制品的清洗和灭菌塑料制品的清洗和灭菌将塑料制品放入含有消毒剂(次氯酸钠)和清洁剂(Decon)的洗液中浸泡30min,自来水冲洗干净;置于超声清洗器中清洗30min;用自来水充分清洗后用去离子水清洗(塑料制品要用专用的刷子或者将自来水连上胶管伸进塑料管内部冲洗);将离心管的盖子和管体分开用图纸包起来,直立放入灭菌锅中湿热灭菌121,20min(高速离心管尤其注意灭菌时要直立放置);自然冷却后置于烘箱中烘干。水的制备和灭菌水的制备和灭菌 细胞培养需要用超纯水(UPW); 第一:反向渗透或蒸馏;第二:碳过滤去除有机或无机胶体(总有机碳TOC 10ug/L);第三:
8、去离子(电阻10M/cm); 高压灭菌121,20min,自然冷却。PBS的制备的制备烧杯中加入1L灭菌超纯水;放在磁力搅拌器上,设定转速200r/min;打开PBS干粉(1L装)加入烧杯中;搅拌至完全溶解;PH计检测PH为7.4,变化0.1;分装至灭菌的储液瓶中,盖子只轻旋一圈,放入灭菌锅中湿热灭菌;自然冷却后盖紧,4或室温保存。配置完全培养基配置完全培养基烧杯中加入1L灭菌超纯水,置于磁力搅拌器上,设定200r/min,边搅拌边加入1袋DMEM或DMEM/F12干粉(已含L-谷氨酰胺和丙酮酸钠);用注射器吸取超纯水,将包装袋内残留培养基洗下;干粉溶解后加入2.438g NaHCO3,搅拌至
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