蛋白质含量的测定.docx

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1、蛋白质含量测定法蛋白质含量测定法，是生物化学讨论中最常用、最基本的分析方法之一。目前常用的有四种古老的经典方法，即定氮法，双缩尿法（BiUret法Folin-酚试剂法（Lowry法）和紫外汲取法。此外还有一种近十年才普遍使用起来的新的测定法，即考马斯亮蓝法（Bradford法其中Bradford法和Lowry法灵敏度最高，比紫外汲取法灵敏1020倍，比Biuret法灵敏100倍以上。定氮法虽然比较简单，但较精确，往往以定氮法测定的蛋白质作为其他方法的标准蛋白质。值得留意的是，这后四种方法并不能在任何条件下适用于任何形式的蛋白质,由于一种蛋白质溶液用这四种方法测定，有可能得出四种不同的结果。每种

2、测定法都不是完善无缺的，都有其优缺点。在选择方法时应考虑：试验对测定所要求的灵敏度和精确度；蛋白质的性质；溶液中存在的干扰物质；测定所要花费的时间。考马斯亮蓝法（Bradford法），由于其突出的优点，正得到越来越广泛的应用。一、微量凯氏（Kjeldahl）定氟法样品与浓硫酸共热。含氮有机物即分解产生氨（消化），氨又与硫酸作用，变成硫酸氨。经强碱碱化使之分解放出氨，借蒸汽将氨蒸至酸液中，依据此酸液被中和的程度可计算得样品之氮含量。若以甘氨酸为例，其反应式如下：CH2COOH+3H2SO42CO2+3SO2+4H2O+NH3(1)NH22NH3 + H2SO4 (NH4)2SO4(2)(NH4)

3、2SO4+2Na0H2H2O+Na2SO4+2NH3(3)反应(11(2)在凯氏瓶内完成，反应(3)在凯氏蒸储装置中进行。为了加速消化，可以加入CuSO4作催化剂，K2SO4以提高溶液的沸点。收集氨可用硼酸溶液，滴定则用强酸。试验?口计算方法这里从略。计算所得结果为样品总氮量，如欲求得样品中蛋白含量，应将总氮量减去非蛋白氮即得。如欲进一步求得样品中蛋白质的含量，即用样品中蛋白氮乘以6.25即得。五种蛋白质测定方法比较如下：方法灵敏度时间原理干扰物质说明凯氏定氮法灵敏度低，费时将蛋白氮转化非蛋白氮用于标准蛋白(Kjedahl适用于810为氨，用酸汲(可用三氯质含量的精确法)0.2小时取后滴定乙酸

4、沉淀蛋测定；干扰少；1.0mg氮，白质而分费时太长误差为2%别）双缩版法灵敏度低中速多肽键+碱性硫酸钱;用于快速测(Biuretl-20mg203Cu2+紫色络TriS缓冲液;定，但不太灵法）O分钟合物某些氨基酸敏；不同蛋白质显色相像紫外汲取法较为灵敏快速蛋白质中的酪各种瞟吟和用于层析柱流50100g510氨酸和色氨酸嗑咤;出液的检测；分钟残基在各种核甘酸核酸的汲取可280nm处的以校正光汲取Folin-酚灵敏度高慢速双缩服反应；硫酸镂；耗费时间长；试剂法5g40磷铝酸-磷铝TriS缓冲液；操作要严格计(Lowry60酸试剂被Tyr甘氨酸；时；法）涉和Phe还原各种硫醇颜色深浅随不同蛋白质变化

5、考马斯亮蓝灵敏度最高快速考马斯亮蓝染强碱性缓冲最好的方法；法15g515料与蛋白质结液；干扰物质少；(Bradford分钟合时，其maxTritonX-IO颜色稳定；法）由465nm变为595nm0；SDS颜色深浅随不同蛋白质变化二、双缩眠法（BiIIret法）（一）试验原理双缩版（nh3conhconh3）是两个分子版经180。C左右加热,放出一个分子氨后得到的产物。在强碱性溶液中，双缩版与CUSO4形成紫色络合物，称为双缩服反应。凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键，或能过一个中间碳原子相连的肽键，这类化合物都有双缩版反应。R-CHCH-RH2O紫色络合物紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成

6、正比，而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关，故可用来测定蛋白质含量。测定范围为l10mg蛋白质。干扰这一测定的物质主要有：硫酸钺、TriS缓冲液和某些氨基酸等。此法的优点是较快速，不同的蛋白质产生颜色的深浅相近，以及干扰物质少。主要的缺点是灵敏度差。因此双缩腑法常用于需要快速，但并不需要非常精确的蛋白质测定。(二)试剂与器材1 .试剂：(1)标准蛋白质溶液：用标准的结晶牛血清清蛋白(BSA)或标准酪蛋白，配制成10mgml的标准蛋白溶液，可用BSA浓度Img/ml的A280为0.66来校正其纯度。如有需要，标准蛋白质还可预先用微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，计算出其纯度，再依据其纯度，称量配制成标准

7、蛋白质溶液。牛血清清蛋白用H2O或0.9%NaCl配制，酪蛋白用O.05NNaOH配制。(2)双缩版试剂：称以1.50克硫酸铜(CuSO4-SH2O)和6.0克酒石酸钾钠（KNaC4H4O6AH2O）,用500毫升水溶解在搅拌下加入300毫升10%NaOH溶液，用水稀释到1升,贮存于塑料瓶中（或内壁涂以石蜡的瓶中I此试剂可长期保存。若贮存瓶中有黑色沉淀消失，则需要重新配制。2 .器材：可见光分光光度计、大试管15支、旋涡混合器等。（三）操作方法1.标准曲线的测定：取12支试管分两组，分别加入0,0.2,0.4,0.6,0.8,1.0毫升的标准蛋白质溶液，用水补足到1毫升，然后加入4毫升双缩版试

8、剂。充分摇匀后，在室温（2025C）下放置30分钟，于540nm处进行比色测定。用未加蛋白质溶液的第一支试管作为空白对比液。取两组测定的平均值，以蛋白质的含量为横座标，光汲取值为纵座标绘制标准曲线。2、样品的测定：取23个试管，用上述同样的方法，测定未知样品的蛋白质浓度。留意样品浓度不要超过10mgmlo三、FOlin一酚试剂法（Lowry法）（一）试验原理这种蛋白质测定法是最灵敏的方法之一。过去此法是应用最广泛的一种方法，由于其试剂乙的配制较为困难（现在已可以订购），近年来渐渐被考马斯亮兰法所取代。此法的显色原理与双缩版方法是相同的，只是加入了其次种试剂，即FOIin-酚试剂，以增加显色量，

9、从而提高了检测蛋白质的灵敏度。这两种显色反应产生深兰色的缘由是：在碱性条件下，蛋白质中的肽键与铜结合生成复合物。Folin一酚试剂中的磷铝酸盐一磷锯酸盐被蛋白质中的酪氨酸和苯丙氨酸残基还原，产生深兰色（祖兰和铝兰的混合物在肯定的条件下,兰色深度与蛋白的量成正比。Folin一酚试剂法最早由LoWry确定了蛋白质浓度测定的基本步骤。以后在生物化学领域得到广泛的应用。这个测定法的优点是灵敏度高，比双缩眠法灵敏得多，缺点是费时间较长，要精确掌握操作时间,标准曲线也不是严格的直线形式，且专一性较差，干扰物质较多。对双缩版反应发生干扰的离子，同样简单干扰Lowry反应。而小寸后者的影响还要大得多。酚类、柠

10、檬酸、硫酸镀、TriS缓冲液、甘氨酸、糖类、甘油等均有干扰作用。浓度较低的尿素（0.5%）,硫酸纳（1%）,硝酸纳（1%）,三氯乙酸（0.5%）,乙醇（5%）,乙醛（5%）,丙酮（0.5%）等溶液对显色无影响，但这些物质浓度高时，必需作校正曲线。含硫酸筱的溶液，只须加浓碳酸钠一氢氧化钠溶液，即可显色测定。若样品酸度较高，显色后会色浅，则必需提高碳酸钠一氢氧化钠溶液的浓度12倍。进行测定时,加FOIin一酚试剂时要特殊当心，由于该试剂仅在酸性PH条件下稳定，但上述还原反应只在pH=10的状况下发生，故当Folin一酚试剂加到碱性的铜一蛋白质溶液中时，必需马上混匀，以便在磷铝酸一磷铝酸试剂被破坏之

11、前，还原反应即能发生。此法也适用于酪氨酸和色氨酸的定量测定。此法可检测的最低蛋白质量达5g0通常测定范围是20250g0（二）试剂与器材1.试剂(1)试剂甲：(A) 10克Na2CO32克NaOH和0.25克酒石酸钾钠(KNaC4H4O6AH2O1溶解于500毫升蒸储水中。(B) 0.5克硫酸铜(CuSO4SH2O)溶解于100毫升蒸储水中，每次使用前，将50份（八）与1份(B)混合，即为试剂甲。(2)试剂乙：在2升磨口回流瓶中，加入100克铸酸钠(Na2W042H20),25克铝酸钠(Na2Mo42H2O)及700毫升蒸储水,再加50毫升85%磷酸，100毫升浓盐酸，充分混合，接上回流管，以

12、小火回流10小时，回流结束时，加入150克硫酸锂(Li2SO4),50毫升蒸储水及数滴液体漠，开口连续沸腾15分钟，以便驱除过度的澳。冷却后溶液呈黄色(如仍呈绿色，须再重复滴加液体漠的步骤稀释至1升，过滤，滤液置于棕色试剂瓶中保存。使用时用标准NaOH滴定，酚酥作指示剂，然后适当稀释，约加水1倍，使最终的酸浓度为IN左右。(3)标准蛋白质溶液：精确称取结晶牛血清清蛋白或y一球蛋白，溶于蒸储水，浓度为250gml左右。牛血清清蛋白溶于水若混浊，可改用09%NaCI溶液。2.器材(1)可见光分光光度计(2)旋涡混合器(3)秒表(4)试管16支(三)操作方法1.标准曲线的测定：取16支大试管，1支作

13、空白，3支留作未知样品，其余试管分成两组，分别加入O,0l,0.2,0.4,0.6,0.8,1.0毫升标准蛋白质溶液(浓度为250gml用水补足到1.0毫升，然后每支试管加入5毫升试剂甲，在旋涡混合器上快速混合，于室温(2025)放置10分钟。再逐管加入0.5墓升试剂乙(Folin一酚试剂)，同样马上混匀。这一步混合速度要快，否则会使显色程度减弱。然后在室温下放置30分钟，以未加蛋白质溶液的第一支试管作为空白对比，于700nm处测定各管中溶液的吸光度值。以蛋白质的量为横座标，吸光度值为纵座标，绘制出标准曲线。留意：因Lowry反应的显色随时间不断深入，因此各项操作必需精确掌握时间，即第1支试管

14、加入5毫升试剂甲后，开头计时，1分钟后，第2支试管加入5毫升试剂甲，2分钟后加第3支试管，余此类推。全部试管加完试剂甲后若已超过10分钟，则第1支试管可马上加入05毫升试剂乙，1分钟后第2支试管加入0.5毫升试剂乙，2分钟后加第3支试管，余此类推。待最终一支试管加完试剂后，再放置30分钟，然后开头测定光汲取。每分钟测一个样品。进行多试管操作时，为了防止出错，每位同学都必需在试验纪录本上预先画好下面的表格。表中是每个试管要加入的量(毫升)，并按由左至右，由上至下的挨次，逐管加入。最下面两排是计算出的每管中蛋白质的量（微克）和测得的吸光度值。F。Iin一酚试剂法试验表格：管号1234567891c)标准蛋白质00.10.20.40.60.81.0(250gml)未知蛋白质0.20.40.6(约250gml)蒸储水1.00.90.80.60.40.200.80.60.4试剂甲5.05.05.05.05.05.05.05.05.05.0试剂乙0.50.50.50.50.50.50.50.50.50.5每管中蛋白质的量(g)吸光度值（A7OO）2.样品的测定：取1毫升样品溶液（其中约含蛋白质20250微克），按上述方法进行操作，取1毫升蒸储水代替样品作为空白对比。通常样品的测定也