胸膜肺炎放线杆菌apxA基因的克隆表达及免疫原性研究.ppt
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1、胸膜肺炎放线杆菌胸膜肺炎放线杆菌apxA基因基因的克隆、表达及免疫原性研究的克隆、表达及免疫原性研究胸膜肺炎放线杆菌胸膜肺炎放线杆菌apxA基因的克基因的克隆、表达及免疫原性研究隆、表达及免疫原性研究第一章第一章 前前 言言 第二章第二章 apxA基因的克隆与原核表达基因的克隆与原核表达第三章第三章 apxA表达蛋白的免疫原性研究表达蛋白的免疫原性研究猪传染性胸膜肺炎概况猪传染性胸膜肺炎概况 猪传染性胸膜肺炎(Porcine contagious pleuropneumonia)是由胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae,APP)引起的猪的呼吸道疾病,
2、其病理特征是引起肺脏广泛的纤维素性渗出、坏死、出血、胸膜粘连,中性细胞、淋巴细胞以及巨噬细胞的浸润,血管栓塞,纤维素沉积等。各种年龄猪对该病均易感,新疫区常急性爆发,急性感染尤其是2425日龄仔猪感染后表现出极高的发病率和死亡率,发病仔猪迅速死亡,死亡率达到20以上,最急性型可达80100 ,并且长期带菌而成为传染性胸膜肺炎再次爆发和流行的潜在传染源,给本病的控制和根除带来困难。同时本病在临床上常与副猪嗜血杆菌、多杀性巴氏杆菌、猪呼吸与繁殖障碍综合征病毒等混合感染,给养猪业造成巨大的经济损失。该病是国际上公认的危害现代养猪业的重大疫病之一。胸膜肺炎放线杆菌概述胸膜肺炎放线杆菌概述 胸膜肺炎放线
3、杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae APP),属于巴氏杆菌科(P a s t e u r e l l a c e a e)放 线 杆 菌 属(Actinobacillus)。APP是一种革兰氏阴性小球杆菌,有荚膜,有菌毛,不形成芽胞,无运动性,最近还发现该菌有鞭毛。胸膜肺炎放线杆菌分两个生物型,即生物型和生物型,生物型为辅酶(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(Nicotinamide Adenine Dinucleotide,NAD)依赖型,生物型为非NAD依赖型。血清型是根据APP表面荚膜和脂多糖抗原性的不同来划分的,现已发现15种血清型,1型-12型、15型属于生物型
4、,13、14型属于生物型。APP菌体形态(G)APP主要毒力因子主要毒力因子溶血素(Apx毒素)脂多糖(LPS)荚膜多糖(CPS)外膜蛋白(OMP)尿素酶(Urease)转铁结合蛋白(Tbp)粘附素溶血外毒素溶血外毒素(Apx毒素)毒素)APP产生的溶血外毒素Apx被认为是APP最重要的毒力因子。在APP的15个血清型中,目 前 已 发 现 产 生 四 种 不 同 的 溶 血 毒 素(Repeats in the structural toxin,RTX),称为Apx(Actinobacillus pleuropneumoniae-RTX-toxin,Apx),即Apx、Apx、Apx和Apx
5、。Apx的毒性最强,表观分子量为105-110kDa,具有很强的溶血活性和细胞毒性作用,分泌Apx的血清型有1、5、9、10和11。毒素型的操纵子包括:毒素激活基因apxC,毒素结构蛋白基因apxA,两个分泌基因apxB和apxD,其中apxC负责编码毒素激活蛋白,apxA编码毒素结构蛋白,apxB和apxD与毒素的分泌有关。apxA基因的N端疏水区是Apx的免疫原区,apxA基因的C端是Ca2+结合区只对毒素发挥毒性产生作用。Apx毒素的表观分子量为103kDa105 kDa,除血清型10以外,其他血清型都可以分泌此毒素。Apx具有弱的溶血活性,它对肺泡巨噬细胞和嗜中性白细胞也有细胞毒性作用
6、。Apx毒素的表观分子量为120 kDa,是由2、3、4、6、8型APP菌分泌的,Apx没有溶血活性,但对肺泡巨噬细胞和嗜中性白细胞有很强的细胞毒性作用。Apx毒素是新近发现的。研究人员发现任何血清型都能在体内分泌Apx毒素蛋白,但体外培养的细菌却不能分泌该毒素。当apxA与表达载体上的开放阅读框1(ORF1)在大肠杆菌中表达时,它有微弱的溶血活性和协同溶血作用(cAMP)。不同不同Apx毒素的生物学特性毒素的生物学特性Apx毒素类型溶血活性细胞毒性分子量(kDa)分泌的血清型Apx强强105-1101、5、9、10、11Apx弱中103-105除了10型以外Apx无强1202、3、4、6、8
7、Apx弱弱200所有血清型Apx操纵子基本结构操纵子基本结构CABD毒素激活基因毒素结构蛋白基因毒素分泌基因胸膜肺炎放线杆菌胸膜肺炎放线杆菌apxA基因的克隆基因的克隆与原核表达与原核表达技术路线:技术路线:apxA基因的克隆与测序重组表达质粒的构建与鉴定诱导表达诱导表达条件的优化PCR鉴定双酶切鉴定Western Blotting不同时间不同IPTG浓度不同温度apxA基因的扩增引物设计引物设计 参照GenBank中apxA核酸序列(D16582),应用Primer5.0软件设计1对引物,其上下游引物中分别含有EcoR和Xho酶切位点,预期扩增长度为3158bp,由北京三博远志生物技术有限公
8、司合成。上游引物:AGC GAA TTC ATG GCT AAC TCT CAG CTC G下游引物:AGC TCG AGA TCC ATT TGC TCC TCC AT apxA基因的基因的PCR扩增结果扩增结果 PCR扩增产物经0.8%琼脂糖凝胶电泳显示大小约为3.2kb,与预期大小一致。重组质粒重组质粒pTA的的PCR和酶切鉴定结果和酶切鉴定结果 对重组质粒pTA进行PCR和酶切鉴定:PCR扩增出约3.2kb的目的条带;EcoRI和 XhoI双酶切后切出大小分别为3.0kb和3.2kb的两条带,结果表明目的片段已克隆到质粒载体上。目的片段序列测定目的片段序列测定 pTA的测序结果与Gen
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