质粒提取及琼脂糖凝胶电泳.ppt

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1、实验六实验六质粒提取及琼脂糖凝胶电泳质粒提取及琼脂糖凝胶电泳DNA重组重组：指不同来源的：指不同来源的DNA片段共价连接，通片段共价连接，通过重新组合，构成了具有两个过重新组合，构成了具有两个DNA分子遗传信息分子遗传信息的新的重组体的新的重组体DNA。DNA体外重组技术体外重组技术：是在分子水平上，根据人们：是在分子水平上，根据人们的需要以人工的方法感兴趣的目的基因，在体外的需要以人工的方法感兴趣的目的基因，在体外与载体与载体DNA分子重组，然后将重组子转入受体细分子重组，然后将重组子转入受体细胞，并筛选出表达重组胞，并筛选出表达重组DNA的活细胞，加以纯化、的活细胞，加以纯化、扩增、成为克

2、隆，这一过程称为扩增、成为克隆，这一过程称为DNA体外重组技体外重组技术。术。DNA体外重组技术是基因工程的核心内容。体外重组技术是基因工程的核心内容。基因克隆简介基因克隆简介 目的基因目的基因 载体载体 酶切，连接酶切，连接 重组基因重组基因 转入转入 受体细胞受体细胞 筛选阳性克隆筛选阳性克隆 分分切、接切、接转转筛筛分子生物学实验流程图分子生物学实验流程图第一次第一次第二次第二次第三次第三次载体载体：可容忍外源性：可容忍外源性DNA片段插入，片段插入，可在细胞间转移并能在细胞内自可在细胞间转移并能在细胞内自主复制的主复制的DNA分子。分子。理想的质粒克隆载体应具有的特性：理想的质粒克隆载

3、体应具有的特性：能在宿主细胞中独立复制，并能能在宿主细胞中独立复制，并能携带携带DNA片段一同扩增片段一同扩增 具有多种常用的限制性内切酶的具有多种常用的限制性内切酶的单酶切位点单酶切位点,即多克隆位点即多克隆位点(MCS,multiple cloning sites)，便于便于进行克隆进行克隆分子量小，可插入较大的外源分子量小，可插入较大的外源DNA而不影响复制而不影响复制易于导入受体细胞具有容易操作的检测表型。如抗生素抗性、易于导入受体细胞具有容易操作的检测表型。如抗生素抗性、-互补显色反应（蓝白斑筛选）互补显色反应（蓝白斑筛选）表达型载体应配备与宿主细胞相适应的启动子，前导序列，表达型载

4、体应配备与宿主细胞相适应的启动子，前导序列，增强子等调控元件增强子等调控元件生物安全性好生物安全性好载体种类：载体种类：质粒质粒 噬菌体载体噬菌体载体 酵母人工染色体（酵母人工染色体（YAC）病毒载体病毒载体常用的克隆载体常用的克隆载体质粒质粒1.定义：质粒是独立存在于定义：质粒是独立存在于细菌染色体外细菌染色体外的，能的，能独立复独立复制制的的环状双链环状双链DNA分子分子。可赋予宿主细胞一定生物学。可赋予宿主细胞一定生物学性状，如：抗生素抗性性状，如：抗生素抗性Ampr等。等。2来源来源存在于细菌、放线菌、真菌以及一些动植物细胞中，在细菌细胞存在于细菌、放线菌、真菌以及一些动植物细胞中，在

5、细菌细胞中最多。中最多。3分类分类质粒按复制方式分为两种类型：松弛型质粒和严紧型质粒质粒按复制方式分为两种类型：松弛型质粒和严紧型质粒严紧型质粒严紧型质粒(Stringent control)严紧型质粒只在细胞周期的一定阶段进行复制严紧型质粒只在细胞周期的一定阶段进行复制,当染色体不复制当染色体不复制时时,它也不能复制它也不能复制,通常每个细胞内只含有通常每个细胞内只含有 1 个或几个质粒个或几个质粒,如如 F 因子。因子。松弛型质粒松弛型质粒(Relaxed control)松弛型质粒在整个细胞周期中随时可以复制松弛型质粒在整个细胞周期中随时可以复制,在每个细胞中有许在每个细胞中有许多拷贝多

6、拷贝,一般在一般在 20 个以上个以上,如如 Col质粒。质粒。松弛型质粒的复制不需要质粒编码的功能蛋白，完全依赖于宿松弛型质粒的复制不需要质粒编码的功能蛋白，完全依赖于宿主提供的半衰期较长的酶。即使蛋白质合成受抑制，质粒的复主提供的半衰期较长的酶。即使蛋白质合成受抑制，质粒的复制依然进行。当抑制蛋白质合成并阻断细菌染色体复制的氯霉制依然进行。当抑制蛋白质合成并阻断细菌染色体复制的氯霉素等抗生素存在时，质粒的拷贝数可达素等抗生素存在时，质粒的拷贝数可达2000-3000拷贝。拷贝。4.质粒的构型质粒的构型（1）.超螺旋超螺旋DNA（supercoiled DNA,sc DNA）超螺旋超螺旋（2

7、）.开环开环DNA(open circle DNA,oc DNA)开环开环DNA（3）.线形线形DNA（linear circle DNA，lc DNA)与本实验有关的两种质粒与本实验有关的两种质粒1.PBR322(作为目的基因供体作为目的基因供体)4363bp2.PUC18(作为载体）作为载体）实验实验 质粒质粒DNADNA提取提取 实验目的实验目的1.掌握碱裂解法提取质粒的原理和方法。掌握碱裂解法提取质粒的原理和方法。2.掌握琼脂糖凝胶电泳的原理和基本操作技术。掌握琼脂糖凝胶电泳的原理和基本操作技术。碱裂解法提取质粒碱裂解法提取质粒原理原理碱裂解法提取质粒碱裂解法提取质粒DNA的原理是根据

8、共价闭合环状质粒的原理是根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体与线性染色体DNA的的分子大小和结构不同分子大小和结构不同利用二利用二者之间者之间变性和复性的差异变性和复性的差异来实现分离的。来实现分离的。强碱强碱及机及机械剪械剪切力切力染色体染色体DNA断裂成小片段线性断裂成小片段线性DNA（机械剪切力（机械剪切力)染色体氢键断裂，双链解离变性（强碱）；染色体氢键断裂，双链解离变性（强碱）；质粒质粒DNA保持闭合环状；保持闭合环状；双链双链DNA并未完全分离（强碱）并未完全分离（强碱）。酸中酸中和至和至中性中性变性的染色体变性的染色体DNA与变性的蛋白质以及细胞碎与变性的蛋白质以及细胞碎片凝聚

9、成网络状大分子不溶性沉淀物片凝聚成网络状大分子不溶性沉淀物质粒质粒DNA又恢复天然构型，溶解在上清液中又恢复天然构型，溶解在上清液中琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳分离琼脂糖凝胶电泳分离DNA原理原理带电颗粒在电场中泳动的速度带电颗粒在电场中泳动的速度由于电场力的作用，使带电颗粒在电场中向一定方由于电场力的作用，使带电颗粒在电场中向一定方向泳动；此颗粒在泳动过程中还受到一个相反方向向泳动；此颗粒在泳动过程中还受到一个相反方向的摩擦力的摩擦力(f)(f)阻挡；当这两种力相等时，颗粒则阻挡；当这两种力相等时，颗粒则以均匀速度以均匀速度()()向前泳动向前泳动fqEfFv式中式中f f为摩

10、擦系数。根据为摩擦系数。根据StokeStoke公式，阻力大小取决于带公式，阻力大小取决于带电颗粒的大小、形状以及所处介质的黏度，即电颗粒的大小、形状以及所处介质的黏度，即式中式中 ff阻力，牛顿；阻力，牛顿；rr粒子半径，米；粒子半径，米；介质粘度，牛顿介质粘度，牛顿秒秒/米米2 2；rf66qEfqEfFv从公式看出，带电颗粒在电场中泳动的速度与从公式看出，带电颗粒在电场中泳动的速度与电电场强度场强度和和带电颗粒的净电荷量带电颗粒的净电荷量成成正比正比，而与，而与颗粒颗粒半径半径和和介质黏度介质黏度成成反比反比 电泳迁移率电泳迁移率tVldlvtdEmd 为带电颗粒泳动的距离为带电颗粒泳动

11、的距离(cm)(cm)；l 为支持物的有效长度为支持物的有效长度(cm)(cm)；t t为通电时间为通电时间(秒秒)；V V为加在支持物两端的实际电压为加在支持物两端的实际电压(V)(V)实验步骤实验步骤加加1.5ml1.5ml培养物于培养物于EPEP管，管，12000rpm12000rpm30S30S 重复一次，最后一次重复一次，最后一次 将将EP管放在吸水纸上扣干管放在吸水纸上扣干除去上清，加入冰的除去上清，加入冰的100 100 l l 溶液溶液I I，剧烈振荡剧烈振荡EPEP管管 以下动作要轻柔以下动作要轻柔 加入加入200200l l 溶液溶液IIII，温和温和颠倒数次，室温放置颠倒

12、数次，室温放置3min3min 加入加入150150l l 冰冰溶液溶液IIIIII，温和颠倒温和颠倒2-32-3次，冰浴次，冰浴5min5min，12000rpm12000rpm10min10min转移上清转移上清到新到新EPEP管（管（统一吸统一吸400 400 l）加入等体积加入等体积氯仿氯仿，温和混匀，温和混匀，12000rpm12000rpm2min2min上层水相转移到新上层水相转移到新EPEP管（管（统一吸统一吸300 300 l）加入加入2 2倍体积倍体积无水乙醇无水乙醇，颠倒混匀，室温静置，颠倒混匀，室温静置5min5min，12000rpm12000rpm 5min5min

13、 弃上清，沉淀中加弃上清，沉淀中加1ml 1ml 70%70%乙醇乙醇，12000rpm12000rpm2min2min 去上清，管平放室温静置去上清，管平放室温静置20-30min20-30min，40 40 l l TE TE 溶解溶解DNADNA 琼脂糖凝胶板的制备琼脂糖凝胶板的制备（封板、（封板、制备制备1%凝胶凝胶、倒胶倒胶、插梳、插梳、凝固后拔梳凝固后拔梳）倒缓冲液，倒缓冲液，加样加样（取质粒取质粒DNA样品液样品液 10l+2l上样缓冲液上样缓冲液，轻轻混匀，轻轻混匀，避免气泡避免气泡）电泳（电泳（100V0.5小时，小时，5V/cm）检测检测（紫外灯下检测紫外灯下检测）主要试剂

14、及作用主要试剂及作用1.solution1.solution：蔗糖蔗糖：增加溶液的粘度：增加溶液的粘度,减少抽提过程中的机械减少抽提过程中的机械剪切作用剪切作用,防止破坏质粒防止破坏质粒.(.(保护作用保护作用)EDTA EDTA：络合掉镁等二价金属离子：络合掉镁等二价金属离子,防止防止DNADNA酶酶对质粒分子的降解作用。（保护作用）对质粒分子的降解作用。（保护作用）TrisHClTrisHCl ：能使溶菌液维持溶菌作用的最适：能使溶菌液维持溶菌作用的最适PHPH范围（缓冲作用）范围（缓冲作用）2.solutionII2.solutionII：SDSSDS的作用裂解细胞和蛋白质变性作用的作用

15、裂解细胞和蛋白质变性作用 NaOHNaOH（PH12PH12）的作用是破坏氢键，使）的作用是破坏氢键，使DNADNA分子变分子变性（性（DNADNA变性作用）变性作用）0.2mol/L NaOH 1%SDS临用前新鲜配制临用前新鲜配制.3.solutionIII3.solutionIII：HACHAC溶液能中和溶液溶液能中和溶液的碱性，使质粒的碱性，使质粒DNADNA复性。复性。KACKAC会与会与SDSSDS形成溶解度很低的盐，并与蛋白质形形成溶解度很低的盐，并与蛋白质形成沉淀而除去；溶液中的染色体成沉淀而除去；溶液中的染色体DNADNA也会与蛋白质也会与蛋白质-SDSSDS复合物缠绕成大分

16、子而与小分子质粒复合物缠绕成大分子而与小分子质粒DNADNA分离。分离。4.氯仿氯仿：进一步沉淀去除蛋白质：进一步沉淀去除蛋白质5.无水乙醇无水乙醇：沉淀质粒：沉淀质粒DNA6.70%乙醇乙醇：洗涤质粒：洗涤质粒DNA7.上样缓冲液上样缓冲液（6x）：）：50%蔗糖蔗糖：增加密度，以确保：增加密度，以确保DNA样品沉入点样样品沉入点样孔内。孔内。溴酚蓝溴酚蓝：指示前沿。：指示前沿。便于观察便于观察DNA片段片段的位置的位置质粒三种构型电泳时泳动速度大小？质粒三种构型电泳时泳动速度大小？超螺旋超螺旋DNA线形线形DNA开环开环DNA在一定电场强度下，电泳泳动速度与分子量大小，分子形在一定电场强度下，电泳泳动速度与分子量大小，分子形状等有关，三种构型分子量大小一致，而形状不同，电泳状等有关，三种构型分子量大小一致，而形状不同，电泳泳动时空间位阻不同，超螺旋最小，其次是线形，最后是泳动时空间位阻不同，超螺旋最小，其次是线形，最后是开环，故泳动速度超螺旋开环，故泳动速度超螺旋DNA线形线形DNA开环开环DNA 超螺旋超螺旋线形线形开环开环点样孔点样孔