酶的提取与分离纯化280.ppt

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1、第三章第三章 酶的提取与分离纯化酶的提取与分离纯化 电泳电泳（electrophoresis,EPelectrophoresis,EP）：指带电粒子：指带电粒子在电场中向着与其所带电荷性质相反的电在电场中向着与其所带电荷性质相反的电极方向移动的过程。极方向移动的过程。电泳技术电泳技术是根据各种带电粒子在电场是根据各种带电粒子在电场中迁移速度的不同而对物质进行分离的实中迁移速度的不同而对物质进行分离的实验技术。验技术。第四节第四节 电电 泳泳一、电泳的基本理论一、电泳的基本理论 1.1.原理原理:在一定在一定pHpH条件下条件下（用（用bufferbuffer），），不同大小、不同大小、形状及带

2、电颗粒在电场中的移动速度不同形状及带电颗粒在电场中的移动速度不同（用迁移率表示），（用迁移率表示），各自集中到特定的位置上而形各自集中到特定的位置上而形成紧密的泳动带。成紧密的泳动带。+-影响影响迁移率迁移率的因素：的因素：颗粒性质：颗粒性质：Q Q越大、越大、r r越小、形状越接近球形，越小、形状越接近球形，v v 越快。越快。电场强度：电场强度：E E越高，越高，v v越快。越快。电泳液：电泳液：pHpH值：离值：离pIpI越远，越远，v v越快。越快。（用（用bufferbuffer保持恒定）保持恒定）离子强度：离子强度越高，离子强度：离子强度越高，v v 越低。越低。通常，缓冲液离子强

3、度在通常，缓冲液离子强度在0.02-0.20.02-0.2之间。之间。电电 渗：在电场中，液体对于固体支持物的相对移动。渗：在电场中，液体对于固体支持物的相对移动。应避免用高电渗物质作支持介质。应避免用高电渗物质作支持介质。自由界面电泳：自由界面电泳：又称移动界面电泳又称移动界面电泳，指在指在没有支持介质的溶液中进行的电泳。没有支持介质的溶液中进行的电泳。区带电泳区带电泳:指有支持介质的电泳，待分离物指有支持介质的电泳，待分离物质在支持介质上分离成若干区带。质在支持介质上分离成若干区带。支持介质的作用支持介质的作用:防止电泳过程中的对流和扩散。防止电泳过程中的对流和扩散。2.2.电泳的分类电泳

4、的分类按支持介质种类的不同，区带电泳可分为：按支持介质种类的不同，区带电泳可分为：纸电泳：用滤纸作支持介质，用于核苷酸定性定量分析。纸电泳：用滤纸作支持介质，用于核苷酸定性定量分析。醋酸纤维素薄膜电泳：常用于分析血清蛋白、胎盘球蛋白，醋酸纤维素薄膜电泳：常用于分析血清蛋白、胎盘球蛋白，优点是简便迅速，便于保存照相，比纸电泳分辨率高。优点是简便迅速，便于保存照相，比纸电泳分辨率高。v以上两种类型的电泳，由于介质的孔径度大，没有分子以上两种类型的电泳，由于介质的孔径度大，没有分子筛效应，主要靠被分离物的电荷多少进行分离。筛效应，主要靠被分离物的电荷多少进行分离。琼脂糖凝胶电泳：琼脂糖凝胶电泳：一般

5、用于核酸的分离分析。琼脂糖凝胶孔径度较大，对一般用于核酸的分离分析。琼脂糖凝胶孔径度较大，对大部分蛋白质只有很小的分子筛效应。大部分蛋白质只有很小的分子筛效应。聚丙烯酰胺凝胶电泳：聚丙烯酰胺凝胶电泳：用于核酸和蛋白质的分离、纯化及检测。分辨率高。用于核酸和蛋白质的分离、纯化及检测。分辨率高。v聚丙烯酰胺和琼脂糖是目前实验室最常用的支持介质。聚丙烯酰胺和琼脂糖是目前实验室最常用的支持介质。3.3.电泳常用设备电泳常用设备（1 1）电泳仪电泳仪 ：提供稳定直流电源的装置：提供稳定直流电源的装置 。常压电泳仪（常压电泳仪（600V600V）高压电泳仪（高压电泳仪（3000V3000V）超高压电泳仪（

6、超高压电泳仪（30000V30000V50000V50000V）（2 2）电泳槽电泳槽：自由界面电泳槽自由界面电泳槽 管状电泳槽管状电泳槽 板状电泳槽板状电泳槽（3 3）附属设备：附属设备：二、聚丙烯酰胺凝胶电泳二、聚丙烯酰胺凝胶电泳！聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamide polyacrylamide gel electrophoresisgel electrophoresis，PAGEPAGE）是以聚丙烯酰胺凝是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质的一种电泳方法。胶作为支持介质的一种电泳方法。1.1.原理原理 聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺单体聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺单体

7、（AcrAcr）和交联剂和交联剂N N，N-N-甲叉双丙烯酰胺甲叉双丙烯酰胺（BisBis）在催在催化剂和加速剂作用下聚合的。化剂和加速剂作用下聚合的。CHCH2 2=CH=CHC=OC=ONHNH2 2CH2=CHCH2=CH C=O C=O NH NH CH CH2 2 NH NH C=O C=O CH CH2 2=CH=CH-CH-CH2 2-CH-CH-CHCH2 2-CH-CH-n nCHCH2 2-CH-CH-C=O C=O C=O C=O NH NH2 2 NH NH CH CH2 2 NH NH C=O C=O-CH-CH2 2-CH-CH-CHCH2 2-CH-CH-n nC

8、HCH2 2-CH-CH-C=O C=O C=O C=O NH NH NH NH2 2丙烯酰胺丙烯酰胺N,NN,N-甲叉双丙烯酰胺甲叉双丙烯酰胺聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺AcrBis 聚丙烯酰胺凝胶聚合的催化体系有两种：聚丙烯酰胺凝胶聚合的催化体系有两种：1 1）化学催化系统：）化学催化系统：AP-TEMEDAP-TEMED 催化剂：过硫酸铵催化剂：过硫酸铵（ammonium persulfateammonium persulfate，APAP）加速剂：加速剂：TEMEDTEMED（N N，N N，NN，N-N-四甲基乙二胺）四甲基乙二胺）2 2）光催化系统：核黄素光（）光催化系统：核黄素光（TEM

9、EDTEMED）催化剂催化剂:核黄素核黄素（维生素（维生素B B2 2）引发剂引发剂:光光 TEMEDTEMED的存在，可加速聚合。的存在，可加速聚合。.凝胶浓度越大凝胶浓度越大（小），（小），孔径越小孔径越小（大），（大），可可分离分子量较小分离分子量较小（大）（大）的颗粒。的颗粒。AcrAcr与与Bis的重量比应在的重量比应在30左右。左右。凝胶浓度和交联度与孔径大小的关系凝胶浓度和交联度与孔径大小的关系样品样品分子量（分子量（DaDa）适宜的凝胶浓度（）适宜的凝胶浓度（）蛋白质蛋白质105510105 52020303015152020101015155 510102 25 5聚丙烯酰胺

10、凝胶浓度参考表聚丙烯酰胺凝胶浓度参考表2.2.分离效应分离效应 连续电泳连续电泳 采用相同孔径的凝胶和相同的缓冲系统采用相同孔径的凝胶和相同的缓冲系统不连续电泳不连续电泳 采用不同孔径的凝胶和不同缓冲体系采用不同孔径的凝胶和不同缓冲体系 电荷效应电荷效应不连续不连续PAGE PAGE 分子筛效应分子筛效应 浓缩效应浓缩效应 连续连续PAGEPAGE 电荷效应电荷效应:分离胶中，蛋白质表面净电荷不分离胶中，蛋白质表面净电荷不同，迁移率不同。同，迁移率不同。分子筛效应：分子筛效应：大小和形状不同的样品分子通大小和形状不同的样品分子通过一定孔径的分离胶时，受阻滞的程度不同而表过一定孔径的分离胶时，受

11、阻滞的程度不同而表现出不同的迁移率。现出不同的迁移率。浓缩效应：浓缩效应：使样品在浓缩胶中被浓缩成一条使样品在浓缩胶中被浓缩成一条窄带，然后再进入分离胶进行分离。窄带，然后再进入分离胶进行分离。不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳系统的不连续性表现在以下几个方面：系统的不连续性表现在以下几个方面：1.1.凝胶分上、下两层，上层为大孔径的浓缩胶，下层为小孔凝胶分上、下两层，上层为大孔径的浓缩胶，下层为小孔径的分离胶。径的分离胶。2.2.缓冲液离子组成及各层凝胶的缓冲液离子组成及各层凝胶的pHpH不同。电极缓冲液为不同。电极缓冲液为pH8.3pH8.3的的Tris-Tris-甘氨酸缓冲

12、液，浓缩胶为甘氨酸缓冲液，浓缩胶为pH6.8pH6.8的的Tris-HClTris-HCl缓冲缓冲液，分离胶为液，分离胶为pH8.8pH8.8的的Tris-HClTris-HCl缓冲液。缓冲液。3.3.在电场中形成不连续的电位梯度。在电场中形成不连续的电位梯度。不连续系统，有三种物理效应，即样品的浓缩效应，凝胶不连续系统，有三种物理效应，即样品的浓缩效应，凝胶的分子筛效应和电荷效应，提高了分辨率。的分子筛效应和电荷效应，提高了分辨率。三、三、SDSSDS聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳 十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulp

13、hate-polyacrylamide gel electrophoresis,sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGESDS-PAGE）简称简称SDSSDSPAGEPAGE。是目前测定蛋白质亚基相对分子量的一种是目前测定蛋白质亚基相对分子量的一种最好的办法最好的办法 。1.1.原理：原理：SDSSDS是种阴离子去污剂，带有大量负电荷，是种阴离子去污剂，带有大量负电荷，与蛋白质结合后使蛋白质所带负电荷大大超过了天与蛋白质结合后使蛋白质所带负电荷大大超过了天然蛋白质原有的负电荷，因而消除或掩盖了不同种然

14、蛋白质原有的负电荷，因而消除或掩盖了不同种类蛋白质间原有电荷的差异。类蛋白质间原有电荷的差异。SDSSDS破坏蛋白质氢键、疏水键，巯基乙醇使二硫破坏蛋白质氢键、疏水键，巯基乙醇使二硫键打开，引起蛋白质构象改变，使蛋白质键打开，引起蛋白质构象改变，使蛋白质SDSSDS复合复合物形状近似椭圆形，短轴相同物形状近似椭圆形，短轴相同（1.8nm1.8nm），），长轴与蛋白质长轴与蛋白质分子量成正比。分子量成正比。因此，蛋白质因此，蛋白质SDSSDS复合物在凝胶中的迁移率不复合物在凝胶中的迁移率不受蛋白质原有电荷和形状的影响，只与椭圆棒长度受蛋白质原有电荷和形状的影响，只与椭圆棒长度（蛋白质分子量）（蛋

15、白质分子量）有关。有关。2.2.操作：操作：（SDS-PAGESDS-PAGE及及PAGEPAGE，即变性及非变性），即变性及非变性）1 1）制胶）制胶:（变性：（变性：buffer buffer 中加中加0.4%SDS0.4%SDS）a.a.分离胶：根据待分离样品的分子大小选择一定分离胶：根据待分离样品的分子大小选择一定浓度的分离胶浓度的分离胶（查表），（查表），配制分离胶溶液：配制分离胶溶液：Acr:Bis=29:1Acr:Bis=29:1，分离胶，分离胶buffer,buffer,TEMED,AP,TEMED,AP,水水 迅速倒胶，加水使液面平坦，室温迅速倒胶，加水使液面平坦，室温0.5

16、h0.5h聚合完聚合完全。全。b.b.浓缩胶：用浓缩胶浓缩胶：用浓缩胶bufferbuffer。插上梳子。插上梳子。2 2）样品制备：）样品制备：a.PAGE:a.PAGE:样品样品缓冲液样品样品缓冲液（蔗糖或甘油指示剂溴酚蓝）（蔗糖或甘油指示剂溴酚蓝）b.SDS-PAGE:b.SDS-PAGE:样品样品缓冲液样品样品缓冲液（SDSSDS，甘油，巯基乙，甘油，巯基乙醇，溴酚蓝），醇，溴酚蓝），煮沸煮沸2-5min2-5min，以除去亚稳态聚合。以除去亚稳态聚合。3 3）加样及电泳：）加样及电泳：SDS-PAGE:SDS-PAGE:电极电极bufferbuffer中加中加0.1%SDS0.1%SDS，溴酚蓝，溴酚蓝距下端距下端1cm1cm时停止电泳。时停止电泳。4 4）固定及染色）固定及染色a.a.固定：将凝胶浸于固定：将凝胶浸于7 7乙酸或乙酸或12.512.5三氯乙酸中三氯乙酸中固定蛋白质组分。固定蛋白质组分。b.b.染色：染色：考马斯亮蓝染色法考马斯亮蓝染色法 银染法银染法（灵敏度比前者高（灵敏度比前者高100100倍）倍）其它的染色方法：氨基黑、阿尔辛蓝，过碘酸其它的染色方法：氨