酶联免疫分析技术.ppt

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1、2013-8-131酶联免疫分析技术ELISA检测免疫检验利用免疫检测原理检测与免疫相关的物质（抗原、抗体、补体、细胞因子等）北京世纪坛医院李莉免疫检验技术1.酶联免疫分析技术2.放射免疫分析技术3.荧光免疫分析技术4.化学发光免疫分析技术5.金标免疫分析技术6.免疫印迹技术7.免疫电泳技术等酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)利用免疫检测原理检测体液中的微量物质（激素、酶、血浆中的微量蛋白、药物浓度等）这些检测结果为临床上确定诊断，分析病情，调整治疗方案和判断预后提供有效的实验依据。酶联免疫分析技术是以酶标记抗原/抗体为主要试剂的

2、一种标记免疫分析技术，利用酶催化底物反应的生物放大作用，提高特异性抗原抗体免疫学反应检测的敏感性.历史1971 年 瑞 典 学 者 Engvail 和 Perlmann,荷 兰 学者 Van Weerman 和 Schuurs 分 别 报 道 将 免 疫 技术 发 展 为 检 测 体 液 中 微 量 物 质 的固 相 免 疫 测定 方 法，即 酶 联 免 疫 吸 附 测 定 法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)。Ab Ag和Ab 分离，然后测定Ab Ag或Ab 的量，2013-8-13酶联免疫吸附实验的原理以待测 抗原（或 抗体）与酶 标抗 体（

3、或 抗原）的特异 结合 反应为 基础，通 过酶 活力测 定来 确定抗原（或抗体）含量。因为 结合 了 免疫 反 应 和 酶催 化 反 应，所以 是一种特异而又敏感的技术。酶免疫技术Ab*+AgAb*Ag+Ab*异相法：*从而推算出 Ag量。Ag*过量Ab*AbAg*Ab均相法：Ab*Ag中的标记物*失去特性，直接测定游离Ab*的量，从而推算出Ag量。Ag*过量Ab*AbAg*Ab1特异性抗原抗体的结合发生在抗原的决定簇与抗体的结合位点之间。化学结构和空间构型互补关系，具有高度的特异性。测定某一特定的物质，而不需先分离待检物。22最适比例2013-8-133 敏感性化学比色法的敏感度为mg/ml

4、水平酶反应测定法的敏感度约为5-10g/ml免疫测定中凝胶扩散法和浊度法的敏感度与酶反应法相仿标记的免疫敏感度可提高数千倍，达 ng/ml水平例如，HBsAg，其敏感度可达 0.1ng/ml。特点灵敏度高特异性强准确性好试剂稳定方法简便酶联免疫吸附实验方法类型：酶联免疫吸附实验的分类双抗体夹心法（三明志法）原理固相支持物表面3包被抗体标记抗体待测物底物一步法 ELISA 反应会出现钩状效应1.双抗体夹心法（主要用于测抗原）2.间接法（主要用于测抗体）3.竞争法（主要用于测小分子抗原/半抗原和抗体）4.捕获法（主要用于测血清中某抗体的亚型）钩状效应（hook effect）一般情况下的双抗体夹心

5、法ELISA反应抗原过量时2013-8-13间接法原理间接法的影响因素正常血清中所含的高浓度的非特异性抗体对间接法的影包被物底物待测物底物标记抗体待测抗体标记抗原包被抗体固相支持物表面竞争法测抗原的原理（7）酶反应终止 液。固相支持物表面响抗原的纯度对间接法测抗体的影响ELISA试剂盒组分：ELISA中有三个必要的试剂：免疫吸附剂、结合物和酶的底物。（1）已包被抗原或抗体的固相载体（免疫吸附剂）；（2）酶标记的抗原或抗体（结合物）；（3）酶的底物；（4）阴性对照品和阳性对照品（定性测定中），参考标准品和控制血清（定量测定中）；（5）结合物及标本的稀释液；（6）洗涤液；结合物即酶标记的抗体（或抗

6、原）是 ELISA中关键的试剂1 酶的催化活性2抗体（或抗原）的免疫活性3含有或少含有游离的抗体（或抗原）4结合物尚要有良好的稳定性。4酶标记的抗原或抗体酶标抗原 天然抗原 重组抗原 合成多肽抗原酶标抗体 单抗 多抗酶底 物显色反应测定波长辣根过氧化物酶邻苯二胺四甲替联苯胺氨基水杨酸邻联苯甲胺2,2-连胺基-2(3-乙基-并噻唑啉磺酸-6)铵盐橘红色黄色棕色兰色蓝绿色492460449425642碱性磷酸酯酶4-硝基酚磷酸盐(PNP)萘酚-AS-Mx磷酸盐+重氮盐黄色红色400500葡萄糖氧化酶ABTS+HRP+葡萄糖葡萄糖+甲硫酚嗪+噻唑兰黄色深蓝色405420-半乳糖苷酶甲基伞酮基半乳糖苷

7、(4MuG)硝基酚半乳糖苷(ONPG)荧光黄色360,4504202013-8-13酶及底物HRP的底物DH2+H2O2D+2H2O上式中，DH 2为供氧体，H2O 2为受氢体。DH2一般为无色化合物，经酶作用后成为有色的产物。DH2如：邻苯二胺(OPD)、四甲基联苯胺(TMB)和ABTS。OPD 氧化后的产物呈橙红色，用酸终止酶反应后，在 492nm 处有最高吸收峰，灵敏度高，比色方便，是 HRP 结合物最常用的底物。ETMB经HRP作用后共产物显蓝色。TMB性质较稳定，可配成溶液试剂，只需与 H2O2溶液混和即成应用液。酶反应终止后，TMB产物由蓝色呈黄色，可在比色计中定量，最适吸收波长为

8、450nm。ABTS虽不如OPD和TMB敏感，但空白值极低，也为一些试剂盒所采用。HRP对氢受体的专一性很高，仅作用于 H2O2、小分醇的过氧化物和尿素过氧化物(urea peroxide)。洗涤液常用的 HRP反应终止液为硫酸，其浓度按加量及比色常用的稀释液为含 0.05%吐温20磷酸盐缓冲液。液的最终体积而异，在板式 ELISA中一般采用 2mol/L。5AP的底物为磷酸酯酶，一般采用对 硝基苯磷酸酯作为底物。产物为黄色的对硝基酚，在 405nm波长处有吸收峰。用 NaOH终止酶反应后，黄色可稳定一时间。AP也有发荧光底物（磷酸 4-甲基伞酮），可用于 ELISA作荧光测定，敏感度较高于用

9、显色底物的比色法。酶反应终止液2013-8-13对照设定阳性对照品(positive control)和阴性对照品(negativecontrol)是检验试验有效性的控制品，同时也作为判断结果的对照。阳性对照品的基本组成应尽量与检测标本的组成相一致，多以含蛋白保护剂的缓冲液为基质。加入的量应与试剂的敏感度相称；在测定中得到的吸光值与受检标本吸光值比较，可以估计标本物质的量。阴性对照品须先行检测确定不含待测物质。例如 HBsAg检测参考标准品定量测定（如甲胎蛋白质，癌胚抗原测定等）应含有制作标准曲线用的参考标准品，应包括覆盖可检测范围的 4-5 个浓度，一般均配入含蛋白保护剂及防腐剂的缓冲液中.

10、酶免疫测定操作中的注意事项的阴性对照品中不可含 HBsAg，最好抗 HBs也是阴性。酶免疫测定操作中的注意事项试剂准备加样温育洗板显色比色结果判断结果报告及解释标本的采取和保存 标本为血浆和血清均可，血清标本应注意避免溶血，红细胞溶解时会释放出具有过氧化物酶活性的物质，以 HRP为标记的ELISA测定中，溶血标本可能会增加非特异性显色，出现假阳性反应。血清标本宜在新鲜时检测。如有细菌污染，菌体中可能含有内源性HRP，也会产生假阳性反应。如在冰箱中保存过久，其中的可发生聚合，在间接法ELISA中可使本底加深。5天内测定的血清标本可放置于 4，超过一周测定的需低温冰存。反复冻融会使抗体效价跌落，所

11、以测抗体的血清标本如需保存作多次检测，宜少量分装冰存。6试剂的准备从冰箱中取出的试验用试剂应待温度与室温平衡后使用。试剂盒 中本次试验不需用的部分应及时放回冰箱保存。同时应将相应的质控取出待温度达到与室温平衡。注意：检验人员应经常核对试剂说明书的具体内容，能够及时发现实验操作程序的更改和标准曲线指控定值的更新。所用蒸馏水或去离子水应保证质量。2013-8-137保温ELISA 属固相免疫测定，抗原、抗体的结合只在固相表面上发生。以抗体包被的夹心法为例，加入板孔中的标本和酶标记抗体，其中的抗原并不是都有均等的和固相抗结合的机会，只有最贴近孔壁的一层溶液中的抗原直接与抗体接触。这是一个逐步平衡的过

12、程，因 此 需经 扩散 才能 达 到反 应的 终点。这 就 是为 什么ELISA反应总是需要一定时间的温育。温育温育所需时间与温度成反比，即温育温度高，则所需时间相对较短。“边缘效应”的排除:使用水浴或在将反应溶液加入至板孔中时，将板和溶液均加热至温育温度（如37），就可以很容易地排除“边缘效应”，并且可提高测定的重复性。保温温 育 常 采 用 的 温 度 有 43 、37、室 温 和 4（冰箱温度）等。37是实验室中常用的保温温度，也是大多数抗原抗体结合的合适温度。保温的方式一般均采用水浴，可将 ELISA 板置于水 浴 箱中，ELISA 板 底 应贴 着水 面，使温 度 迅速 平衡。为避免

13、蒸发，板上应加盖。另外保温的方式还有ELISA仪器附有特制的电热块反 应 板 均 不 宜 叠 放，以 保 证 各板 的 温度 都 能 迅速平衡。室 温 温 育 的 反 应，操 作 时 的 室温 应 严格 限 制 在规 定 的 范围 内，标准 室 温温 度 是指 20-25，应注 意温育的温度和时间应按规定力求准确。为保证这一点，一个人操作时，一次不宜多于两块板同时测定。加样ELISA中一般有 3次加样步聚：即加标本，加酶结合物，加底物。加样时应将所加物加在 ELISA板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可溅出，不可产生气泡。加标本一般用微量加样器，按规定的量加入板孔中。每次加标本应更换 吸

14、头，以 免 发 生 交 叉 污 染。然 后 在 微 型 震 荡 器 上 震 荡 1分 钟 以 保 证充分混和。加酶结合物应用液和底物应用液时可用定量多道加液器，使加液过程迅速完成。从滴瓶中滴加试剂，除了要注意滴加角度外，滴加速度也很重要，滴加太快，很容易出现重复滴加或加在两孔之间的现象，这样就会在孔内的非包被区出现非特异吸附，从而引起非特异显色。洗涤洗涤在ELISA过程中虽不是一个反应步骤，但却也决定着实验的成败。ELSIA洗涤：达到分离游离的和结合的酶标记物的目的。清除残留在板孔中游离的物质，以及非特异性地吸附的干扰物质。可以说在ELISA操作中，洗涤是最主要的关键技术。洗涤的方式：自动洗涤

15、仪手工操作全自动加样系统的标本“交叉污染”问题洗板每次温育后洗板是否彻底，与非特异背景显色有很大关系。洗板液一般为含 0.05%Tween20的中性PBS。Tween20 为 一 种 非 离 子 去 垢 剂，既 含 亲 水 基 团，也 含 疏水基团。洗涤作用机理，借助其疏水基团与固相上蛋白的疏水基团形成疏水键，从而削弱蛋白与固相的吸附，同时在其亲水基团与液相中水分子的结合作用下，促使蛋白质脱离固相而进入液相洗 板 液 中 Tween20 浓 度 高 于 0.2%，可 使 包 被 于 固 相 上 的抗原或抗体解吸附而影响试验测定下限。2013-8-138显色显色是ELISA中的最后一步温育反应，

16、此时酶催化无色的底物生成有色的产物。反应的温度和时间仍是影响显色的因素。在一定时间内，阴性孔可保持无色，而阳性孔则随时间的延长而呈色加强。注意：OPD底物显色一般在37反应20-30分钟后即不再加深，再延长反应时间，可使本底值增高。OPD底物液受光照会自行变色，显色反应应避光进行，显色反应结束时加入终止液终止反应.OPD产物用硫酸终止后，显色由橙黄色转向棕黄色。显 色加入底物 A和B后，应振荡混匀当底物为 OPD时，显色反应应避光进行一般商品试剂盒显色反应条件为 37 或室温反应 1530 min。从理论上说，37 30分钟才可以使 HRP的底物催化反应完全，尽管在最初的 10分钟内，绝大部份催化反应即可完成。因此，为使弱阳性样本孔能有充分的显色，建议在 37下反应2530分钟后，终止反应比色测定。显色TMB 受光照的影响不大，可在室温中置于操作 台 上，边 反应 观 察 结果。但 为保 证 实 验 结 果的稳定性，宜在规定的适当时间阅读结果。TMB 经 HRP 作 用 后，约 40 分 钟 显 色达 顶 峰，随即逐渐减弱，至 2 小时后即可完全消退至无色。TMB 的终止液有多种，叠氮