重组门冬酰胺酶制备表达纯化.ppt

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1、酶的分类酶的分类酶单纯蛋白质（多种氨基酸组成）结合蛋白质酶蛋白（蛋白部分）辅酶或辅基（非蛋白部分）金属：如Cu2、Mn2金属有机物：如铁朴啉不含金属的有机物如：烟酰胺、VB2等的衍生物酶胞外酶胞内酶游离酶结合酶门冬酰胺酶门冬酰胺酶 L-天门冬酰胺酶 AnsB 能催化天门冬酰胺水解生成天冬氨酸和氨。淋巴瘤和白血病细胞通常不能合成天门冬酸胺，L-天门冬酸胺酶将阻止癌细胞蛋白质合成而导致癌细胞死亡。在临床上，L-天门冬酰胺酶已广泛用于治疗白血病和淋巴瘤。但目前国内尚不能生产，国外也仅有低产酶能力的大肠杆菌野生株产品，生产成本高，药价昂贵。基因工程菌产品既能填补国内空白，又能大幅度降低生产成本。参考文

2、献1-重组与表达 刘景晶，李晶，吴梧桐，胡梅清.大肠杆菌L-天门冬酰胺酶基因的高效表达 中国药科大学生物化学教研室,南京210009南京铁道医学院生物化学教研室,南京2100092-提取与纯化刘景晶,金健勤,戴海滨,吴梧桐.大肠杆菌L门冬酸胺酶的提取和纯化中国药科大学生化教研室,南京210009重组与表达材料材料 限制酶 Ncol、Hind III及T 4 DNA 连接酶，购自 Promega 公司；Taq 酶、dNTP、IPTG 购自华美公司；丙烯酰胺、N,N-甲叉双丙烯酰胺、SDS购自sigma 公司。pKK 233-2 购自clonetech 公司；pKK 233-ansB 是将代PCR

3、 扩增得到的AnsB 基因DNA 用 Ncol 和Hind III消化后，定向插入pKK 233-2 的多克隆位点而得到的重组质粒。实验方法 PCR扩增扩增AnsB基因基因重组质粒重组质粒PKK233-ansB 的构建的构建 阳性转化子的筛选阳性转化子的筛选 PCR扩增扩增AnsB基因基因 模板的制备：用接种环挑取CPU 210009菌体少许，在裂解液(1TritonX-100,2mmol/LTris-HCl pH8.5,2mmol/L EDTA)1ml中振散，95C加热处理液10min,吸取处理液5ul用于PCR。引物：E1:5-GGCCATGGAGTTTTTCAAAAAGACGGCACIT

4、GC 一3 E2:5-GGAAGCTTGAGAATGCCGTGATAC 一3 11：5-GGCCATGGAGT111TCAAAAAGACGCACTTGC一3 12:5-GGAAGCTTAGACTGATTGAAGATCTGCTGG 一3 扩增条件：84C变性1 min;60C复性2 min;72C延伸1 min；循环28次。重组质粒重组质粒PKK233-ansB 的构建的构建 PcR 扩增后的DNA片段及质粒pKK 233-2 同时分别用限制酶Ncol 和Hindl 消化并用琼脂搪凝胶电泳分离和回收质粒大片段；将消化后的DNA 片段和电泳回收的质粒大片段用T 4.DNA 连接酶连接，连接产物经琼

5、脂糖凝胶电泳回收后转化HB 1 01、71/15、ATCc 9637、JM107、cPU 210009，筛选获得相应的阳性转化子。阳性转化子的筛选阳性转化子的筛选 将涂布在含氨节青霉素的LB 平板上生长出的单菌落用牙签逐个挑入方格化的新鲜LB 平板上，为每个克隆编号。平板置37C 温箱中过夜，待菌落形成后，用灭菌牙签逐个挑取少量菌体，移入预先加有0.1 mol/L 硼酸缓冲液（pH 8.4)50ul的酶标板反应孔内，待菌体分散后，每孔各加入0.04 mol/L 天门冬酞胺底物溶液50 ul,37C 保温15 min，加奈氏试剂50 ul，呈深棕红色孔内对应的单菌落即为阳性转化子。条件选择条件选

6、择酶的纯度酶的纯度酶的浓度酶的浓度金属离子金属离子pH温度、时间温度、时间晶种晶种 酶的分离纯化工作中的注意事项酶的分离纯化工作中的注意事项1.1.防止酶蛋白变性防止酶蛋白变性2.2.防止复因子丢失防止复因子丢失3.3.防止酶被蛋白防止酶被蛋白 水解酶降解水解酶降解提取纯化蔗糖溶液提取法蔗糖溶液提取法 L-天冬酰胺酶的鉴定（肽图分析）天冬酰胺酶的鉴定（肽图分析）酶活力的测定酶活力的测定酶分子量测定酶分子量测定 提取纯化 L-天门冬酰胺的提取（蔗天门冬酰胺的提取（蔗糖溶液提取法）糖溶液提取法）向菌体细胞中加入5倍体积的蔗糖抽提液（蔗糖40，溶菌酶200mg/L,EDTA 10mmol/L,pH7

7、.5.）在30C震2小时，8000r/min离心30min,收集上清酶液。L-天冬氨酸酶的纯化天冬氨酸酶的纯化蔗糖溶液提取法获得的酶液,加入硫酸铵至55饱和度，调pH至7.0,室温搅拌1小时,离心除去沉淀。上清液中加入硫酸铵到90饱和度，离心收集沉淀。沉淀物用50mmol/L、pH7.0磷酸缓冲液溶解并透析。透析后的酶液通过预先用10mmol/L、pH7.6的磷酸缓冲液平衡的DEAE-纤维素DE52层析柱（1.030cm）。用30mmol/L磷酸缓冲液洗脱,流速为40ml/h。每分钟收集一定的洗脱液并于280处测定紫外吸收值，绘制洗脱曲线（如图如图1）Ph4.8,通过预先用50mmol/L,p

8、H4.9磷酸缓冲液平衡的CM-纤维素 层析柱（1.08.0cm）,用50mmol/L、pH5.2 磷酸缓冲液洗脱,收集显示天门冬酞胺酶活力的组分,冻干后得天门冬酰胺冻干粉。再进行称量计算产量。L-天冬酰胺酶的鉴定（肽图分析）天冬酰胺酶的鉴定（肽图分析）取适量样品加入1%NH4HCO3溶解至1.0 mg/ml，按1 30(W/W)加入胰蛋白酶，370.5保温16 h，50%冰醋酸终止反应备用。色谱条件流动相：A为0.1%TFA 水，B为0.1%TFA，乙腈 水(80 20)。梯度：060 min，B：030%；60120 min，B：30%38%；120175，B：38%80%。流速：0.2 ml/min；上样量：自动进样50 l；检测波长：210 nm。酶活力的测定酶活力的测定取004mol/L L-天门冬酰胺1 ml,0.1 mol/L pH8.4硼酸一硼酸钠缓冲液lml，取酶液0.2ml于试管中，于37C水浴保温10min，加15三氯乙酸0.5ml终止反应，经4000r/min离心，取上清液1ml,奈氏试剂2 ml和蒸馏水7 ml，放置15 min后于500nm波长比色测定生成的氨。在上述条件下，每分钟催化L一天门冬酰胺水解释放1umol氨所需的酶量定义为一个酶活力单位U。1.3.7酶分子量测定酶分子量测定SDS-PAGE