第05章代谢物酶法分析技术.ppt
《第05章代谢物酶法分析技术.ppt》由会员分享,可在线阅读,更多相关《第05章代谢物酶法分析技术.ppt(43页珍藏版)》请在第壹文秘上搜索。
1、第五章代谢物酶法分析技术第五章代谢物酶法分析技术 第五章第五章 代谢物酶法分析技术代谢物酶法分析技术第五章代谢物酶法分析技术第五章代谢物酶法分析技术2代谢物酶法分析技术是指用酶法分析的方法来测代谢物酶法分析技术是指用酶法分析的方法来测定人体內的代谢物或代谢产物的技术。定人体內的代谢物或代谢产物的技术。酶法分析(酶法分析(enzymatic method)是以酶为试剂测定酶促)是以酶为试剂测定酶促反应的底物、辅酶、辅基、激活剂或抑制剂,以及利用反应的底物、辅酶、辅基、激活剂或抑制剂,以及利用酶促反应测定酶活性的一类方法。酶促反应测定酶活性的一类方法。代谢物酶法分析技术的概念代谢物酶法分析技术的概
2、念第五章代谢物酶法分析技术第五章代谢物酶法分析技术3 代谢物酶法分析代谢物酶法分析 平衡法(终点法)平衡法(终点法)速率法(动力学法)速率法(动力学法)代谢物酶法分析的理论基础代谢物酶法分析的理论基础1第五章代谢物酶法分析技术第五章代谢物酶法分析技术4平衡法是指标本中待测物的量有限,经过酶促反应逐平衡法是指标本中待测物的量有限,经过酶促反应逐渐被消耗,当剩余的底物量很小(渐被消耗,当剩余的底物量很小(1%5%)时,指示)时,指示反应信号逐渐达到平衡,即通常所说的终点,所以又称反应信号逐渐达到平衡,即通常所说的终点,所以又称为终点法为终点法(end-point method)。平衡法的特点是测定
3、底物的总变化量,平衡法的特点是测定底物的总变化量,即测定的是即测定的是“浓度浓度”。平衡法基本理论平衡法基本理论(1)第五章代谢物酶法分析技术第五章代谢物酶法分析技术5速率法速率法(rate assay)又称动力学法、连续监测法,测又称动力学法、连续监测法,测定的是速率(通常指的是初速度),依据是当底物的定的是速率(通常指的是初速度),依据是当底物的消耗量较小时消耗量较小时(5%),酶促反应呈一级反应,此时的,酶促反应呈一级反应,此时的反应速度反应速度(v)与代测物的浓度成正比例。与代测物的浓度成正比例。速率法的关键是如何使酶促反应成一级反应。速率法的关键是如何使酶促反应成一级反应。速率法基本
4、理论速率法基本理论(2)第五章代谢物酶法分析技术第五章代谢物酶法分析技术6在临床操作中,只要测定期间待测物消耗在临床操作中,只要测定期间待测物消耗 Km2,这时的酶促反应动力学可按单底,这时的酶促反应动力学可按单底物法处理,整个反应只与待测物有关,呈一级反应物法处理,整个反应只与待测物有关,呈一级反应动力学。动力学。但在以但在以NADH 或或NADPH 为底物的终点法测定中,为底物的终点法测定中,因因340 nm 吸光度吸光度的限制,辅酶的用量不可能过高。的限制,辅酶的用量不可能过高。第五章代谢物酶法分析技术第五章代谢物酶法分析技术12在在340 nm 处测定吸光度的处测定吸光度的增加来进行定
5、量的方法增加来进行定量的方法乳酸测定乳酸测定双底物反应直接测定法双底物反应直接测定法 LD乳酸乳酸+NAD+丙酮酸+NADH+H+丙酮酸测定丙酮酸测定 在在340 nm 处测定吸处测定吸光度的下降来进行定量的方法光度的下降来进行定量的方法 乳酸乳酸+NAD+丙酮酸+NADH+H+LD第五章代谢物酶法分析技术第五章代谢物酶法分析技术13酶促反应的底物或产物如果没有可直接检测的成分,酶促反应的底物或产物如果没有可直接检测的成分,将反应某一产物偶联到另一个酶促反应中,从而达到将反应某一产物偶联到另一个酶促反应中,从而达到检测目的的方法称酶促偶联法。检测目的的方法称酶促偶联法。最常用的偶联指示系统有两
6、个:一个是脱氢酶最常用的偶联指示系统有两个:一个是脱氢酶指示系统,另一个为过氧化物酶指示系统。指示系统,另一个为过氧化物酶指示系统。ACBAEiEa 酶偶联法酶偶联法(2)第五章代谢物酶法分析技术第五章代谢物酶法分析技术14脱氢酶指示系统脱氢酶指示系统 氧化型辅酶氧化型辅酶NAD(P)+在在340 nm 处没有吸处没有吸收峰收峰,还原型辅酶还原型辅酶NAD(P)H在在340 nm 处有吸收峰处有吸收峰.第五章代谢物酶法分析技术第五章代谢物酶法分析技术15脱氢酶指示系统脱氢酶指示系统 以脱氢酶为指示酶的系统测定的是氧化型辅酶以脱氢酶为指示酶的系统测定的是氧化型辅酶(NAD+)或氧化型辅酶或氧化型
7、辅酶(NADP+)变为还原型变为还原型NAD(P)H后在后在340 nm 处的吸光度增高来计算出被处的吸光度增高来计算出被测物的浓度,也可利用脱氢酶的逆反应,将还原型测物的浓度,也可利用脱氢酶的逆反应,将还原型NAD(P)H 变为氧化型变为氧化型NAD(P)+,测定,测定340 nm 处处吸光度的下降来计算被测物的浓度。吸光度的下降来计算被测物的浓度。第五章代谢物酶法分析技术第五章代谢物酶法分析技术16脱氢酶指示系统脱氢酶指示系统 血清葡萄糖己糖激酶法测定血清葡萄糖己糖激酶法测定 Glu+ATPG-6-P+ADPPDG 6G-6-P+NADP+P-6-GA+NADPH+H+指示酶反应将指示酶反
8、应将NADP+转化为转化为NADPH+H+,测定,测定340 nm吸光度上升的吸光度上升的速度与葡萄糖的含量成正比速度与葡萄糖的含量成正比 第五章代谢物酶法分析技术第五章代谢物酶法分析技术17脱氢酶指示系统脱氢酶指示系统 血清尿素测定血清尿素测定 尿素尿素+H2O 尿素酶2NH3+CO2NH3+-酮戊二酸酮戊二酸+NADH+H+谷氨酸谷氨酸+H2O+NAD+测定测定340nm吸光度下降的速度与尿素的含量成正吸光度下降的速度与尿素的含量成正比,可以用速率法测定;也可以用平衡法测定比,可以用速率法测定;也可以用平衡法测定 第五章代谢物酶法分析技术第五章代谢物酶法分析技术18常用的试剂酶有乳酸脱氢酶
- 配套讲稿:
如PPT文件的首页显示word图标,表示该PPT已包含配套word讲稿。双击word图标可打开word文档。
- 特殊限制:
部分文档作品中含有的国旗、国徽等图片,仅作为作品整体效果示例展示,禁止商用。设计者仅对作品中独创性部分享有著作权。
- 关 键 词:
- 05 代谢物 分析 技术