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1、Genetic Engineering1.1.基因工程概述基因工程概述2.2.基因工程的基础知识与基本技术基因工程的基础知识与基本技术3.3.基因工程所需基本条件基因工程所需基本条件4.4.基因工程的操作过程基因工程的操作过程5.5.目的基因的获取目的基因的获取6.6.克隆基因的表达克隆基因的表达7.7.转基因生物技术转基因生物技术 一般来说，目的基因的克隆战略分为两大类：一类是构建感兴趣的生物个体的基因文库，即将某生物体的全基因组分段克隆，然后建立合适的筛选模型从基因组文库中挑出含有目的基因的重组克隆；另一类是利用PCR扩增技术甚至化学合成法体外直接合成目的基因，然后将之克隆表达。5.目的基

2、因的获取目的基因的获取目的基因：目的基因：准备要分离、改造、扩增或表达的基因。准备要分离、改造、扩增或表达的基因。5.目的基因的获取目的基因的获取l 基因组基因组DNA片断化片断化l 化学合成目的基因化学合成目的基因l目的基因的保存和扩增目的基因的保存和扩增l目的基因的分离和扩增目的基因的分离和扩增一、限制性内切酶法一、限制性内切酶法用限制性内切酶把基因组用限制性内切酶把基因组DNA切成不同切成不同大小的片断。大小的片断。酶切酶切由于带有粘性末端，产物可以直接与载体连接。由于带有粘性末端，产物可以直接与载体连接。1.优点优点2.缺点缺点目的基因目的基因内部内部也可能有该内切酶的切点。目的也可能

3、有该内切酶的切点。目的基因也被切成碎片！基因也被切成碎片！BamH IBamH IBamH Igene二、随机片断化二、随机片断化1.限制性内切酶局部消化法限制性内切酶局部消化法控制内切酶的用量和消化时间，使基因组中控制内切酶的用量和消化时间，使基因组中的酶切位点只有一部分被随机切开。的酶切位点只有一部分被随机切开。内切酶识别位点的碱基数内切酶识别位点的碱基数影响所切出的产物的长度和随机程度。影响所切出的产物的长度和随机程度。1）4bp的内切酶的内切酶平均每平均每46（4096）bp一个切点。一个切点。2）6bp的内切酶的内切酶平均每平均每44（256）bp一个切点。一个切点。随机程度高。如随

4、机程度高。如Hae、AluI、Sau3A。内切酶粘性末端内切酶粘性末端能与常用克隆位点相连。能与常用克隆位点相连。（Sau3ABamH I）2.机械切割法机械切割法（1）超声波）超声波超声波强烈作用于超声波强烈作用于DNA，可使其断裂成，可使其断裂成约约300bp的随机片断。的随机片断。（2）高速搅拌）高速搅拌1500转转/分下搅拌分下搅拌30min，可产生约，可产生约8kb的随的随机片断。机片断。1976年年H.G.Khorana提出了用化学方法合成提出了用化学方法合成基因的设想，并于基因的设想，并于1979年在年在science上发表了率先上发表了率先成功地合成大肠杆菌酪氨酸成功地合成大肠

5、杆菌酪氨酸tRNA基因的论文。基因的论文。第二节第二节 化学合成目的基因化学合成目的基因一、目前常用的方法一、目前常用的方法磷酸二酯法、磷酸二酯法、磷酸三酯法、磷酸三酯法、亚磷酸三酯法、亚磷酸三酯法、固相合成法固相合成法自动化合成法、自动化合成法、保护保护dNTP的的5端端P 或或3端端-OH 用酸或碱的脱保护用酸或碱的脱保护（1）原理）原理1.磷酸二酯法磷酸二酯法 带保护的单核苷酸连接带保护的单核苷酸连接保证合成反应的定向进行。保证合成反应的定向进行。带带5保护的单核苷酸与带保护的单核苷酸与带3保护的另一个单保护的另一个单核苷酸以核苷酸以磷酸二酯键磷酸二酯键连接起来。连接起来。（2）合成过程

6、）合成过程下一个下一个5端保护的单核苷酸又可以同端保护的单核苷酸又可以同3端保护的二核苷酸聚合端保护的二核苷酸聚合 原理与磷酸二酯法一样。只是参加反应的单原理与磷酸二酯法一样。只是参加反应的单核苷酸都是在核苷酸都是在3端磷酸和端磷酸和5-OH上都先连接了一上都先连接了一个保护基团。个保护基团。2.磷酸三酯法磷酸三酯法DMT：二甲氧基三苯甲基二甲氧基三苯甲基 将第一个核苷酸的将第一个核苷酸的3-OH端固定在端固定在固相支持物固相支持物上。上。固相磷酸三酯合成法固相磷酸三酯合成法目前通用的合成方法。目前通用的合成方法。合成的二核苷酸连接处有三个酯键！合成的二核苷酸连接处有三个酯键！固相磷酸三酯合成

7、固相磷酸三酯合成过程：过程：固相支持物固相支持物结果是全保护的结果是全保护的DNA：5 DMT,3固相支持物固相支持物,核苷酸之核苷酸之间对氯苯，最后脱保护间对氯苯，最后脱保护固相固相 支持物支持物固相固相 支持物支持物COHGHHHHOCH2ODMTPOMeNCHMeMeCHMeMeOHGHHHHOCH2ODMTPOMeNCHMeMeCHMeMeH化学合成的化学合成的DNA片断一般在片断一般在200bp以内。以内。二、二、化学合成化学合成DNA片断的组装片断的组装用用T4多核苷酸激酶多核苷酸激酶使各个片段的使各个片段的5端带上磷端带上磷酸。酸。1.互补连接法互补连接法预先设计合成的片断之间都

8、有预先设计合成的片断之间都有互补区域互补区域，不同片断之间的互补区域能形成有不同片断之间的互补区域能形成有断点断点的的完整双链。完整双链。（2 2）5端磷酸化端磷酸化（1 1）互补配对）互补配对（合成的（合成的DNADNA单链的单链的5 5端是端是-OH-OH）T4 DNA连接酶连接酶T4多核苷酸激酶多核苷酸激酶使使5-OH磷酸化磷酸化完整的完整的DNA双链双链（3 3）连接酶连成完整双链连接酶连成完整双链2.互补延伸连接法互补延伸连接法 预先设计的片断之间有预先设计的片断之间有局部互补区局部互补区，可以相，可以相互作为另一个片断延长的引物，用互作为另一个片断延长的引物，用DNA聚合酶聚合酶延

9、伸成完整的双链。延伸成完整的双链。3 5 5 3 5 3 T4DNA连接酶连接酶Klenow片段片段引物引物1.直接合成基因直接合成基因三、三、寡聚核苷酸化学合成的优点寡聚核苷酸化学合成的优点2.合成引物（合成引物（20mer左右）左右）（1 1）mRNA的含量很低，很难作的含量很低，很难作cDNA 3.合成探针序列合成探针序列4.定点突变合成定点突变合成合成带有合成带有定点突变定点突变的基因片断。的基因片断。（2）有些基因比较短，化学合成费用较低）有些基因比较短，化学合成费用较低DNA合成仪合成仪5.合成人工接头或衔接物合成人工接头或衔接物含有各种酶切位点含有各种酶切位点人工接头人工接头（A

10、daptor）或）或衔接衔接物物（Linker）序列。）序列。EcoRIEcoRILinkerAdaptor 将某种生物细胞的将某种生物细胞的整个基因组整个基因组DNA切割成切割成大小合适的片断，并将大小合适的片断，并将所有这些片断所有这些片断都与适都与适当的载体连接，引入相应的宿主细胞中当的载体连接，引入相应的宿主细胞中保存保存和扩增和扩增。理论上讲，这些重组载体上带有了。理论上讲，这些重组载体上带有了该生物体的该生物体的全部基因全部基因，称为基因文库。，称为基因文库。一、基因文库的构建一、基因文库的构建1.基因文库（基因文库（gene library）第三节第三节 目的基因的保存和扩增目的

11、基因的保存和扩增（2 2）目前常用的载体目前常用的载体 2.构建基因文库的载体选用构建基因文库的载体选用载体能够容载的载体能够容载的DNA片断大小直接影响到构建完片断大小直接影响到构建完整的基因文库所需要的整的基因文库所需要的重组子重组子的数目。的数目。载体容量越大，所要求的载体容量越大，所要求的DNA片断数目越少，片断数目越少，所需的所需的重组子重组子越少。越少。（1 1）对载体的要求）对载体的要求 载体系列：载体系列：容量为容量为 24 kp cosmid载体：载体：容量为容量为 50 kb YAC：容量为容量为 1 Mb BAC:容量为容量为 300 kb断点完全随机，片断长度合适于载体

12、连接。不断点完全随机，片断长度合适于载体连接。不能用一般的限制性内切酶消化法。能用一般的限制性内切酶消化法。（1）染色体）染色体DNA大片段的制备大片段的制备3.基因文库构建的一般步骤基因文库构建的一般步骤超声波（超声波（300bp）或机械搅拌（）或机械搅拌（8kb）。）。物理切割法：物理切割法：内切酶内切酶Sau3A进行局部消化。可得到进行局部消化。可得到10-30kb的随机片断。的随机片断。酶切法：酶切法：（2）载体与基因组）载体与基因组DNA大片段的连接大片段的连接 粘性末端直接连接粘性末端直接连接载体与外源载体与外源DNA大片段的两个末端都有大片段的两个末端都有相同的粘性末端。相同的粘

13、性末端。如：如：Sau3A与与BamHI的酶切末端。的酶切末端。直接连接、人工接头或同聚物加尾。直接连接、人工接头或同聚物加尾。人工接头法（人工接头法（adapter）人工合成的限制性内切酶粘性末端片断。人工合成的限制性内切酶粘性末端片断。各种酶的接头可以向公司定做或购买。各种酶的接头可以向公司定做或购买。接上人工接头接上人工接头粘性末端粘性末端CCCCCC末端转移酶末端转移酶粘性末端粘性末端 同聚物加尾同聚物加尾4.基因组文库的大小基因组文库的大小一个文库要包含一个文库要包含99%的基因组的基因组DNA时所需要时所需要的克隆数目。的克隆数目。N=ln(1-p)ln(1-f)p:文库包含了整个

14、基因组文库包含了整个基因组DNA的概率的概率（99%）f:插入载体的插入载体的DNA片断的平均长度占整个基因片断的平均长度占整个基因 组组DNA的的百分数百分数N：所需的重组载体数（克隆数）：所需的重组载体数（克隆数）例如：人的基因组是例如：人的基因组是 3109 bp，插入，插入DNA片断片断的平均长度如果是的平均长度如果是1.7104 bpN=ln(1-p)ln(1-f)=ln(1-99%)ln(1-f)=4.61GfN=4.61GfG：Genome大小；大小；f：fragment大小大小N=4.61Gf=4.6131091.7104=8.11051.cDNA以以mRNA为模板为模板逆转录

15、逆转录出的出的DNA称称cDNA。2.cDNA library二、二、cDNA文库的构建文库的构建mRNAcDNA3 3 5 5 反转录酶反转录酶引物引物利用某种生物的利用某种生物的总总mRNA合成合成cDNA，再将这些，再将这些cDNA与载体连接，转入细菌细胞中进行保存和扩与载体连接，转入细菌细胞中进行保存和扩增，称增，称cDNA文库。文库。3.cDNA文库的特点文库的特点注：注：cDNAcDNA文库包含某种生物体特定组织、特定文库包含某种生物体特定组织、特定发育阶段表达的基因。发育阶段表达的基因。分离分离mRNA用商业化的用商业化的Oligo dT纤维柱。纤维柱。利用利用mRNA都含有一段

16、都含有一段polyA尾巴，将尾巴，将mRNA从总从总RNA（rRNA、tRNA等）中等）中分离纯化。分离纯化。mRNA只占总只占总RNA的的1%-5%。（2）mRNA的分离纯化的分离纯化 原理原理 mRNA的分离纯化的分离纯化Column（柱）（柱）（1）总）总RNA（total RNA）提取）提取4.构建构建cDNA文库的一般步骤文库的一般步骤反转录酶反转录酶（3）cDNA的合成的合成 cDNA第一链合成第一链合成逆转录酶能以逆转录酶能以RNA为模板合成为模板合成DNA。用用Oligo dT（或随机引物）作引物，合成（或随机引物）作引物，合成cDNA的第一链。的第一链。mRNAcDNA3 5 5 AAAAAAATTTTTTTOligo dT引物引物用用碱碱处理或用处理或用RNaseH降解降解mRNA-DNA杂交分杂交分子中的子中的mRNA。mRNAcDNA3 3 5 5 反转录酶反转录酶引物引物mRNAcDNA第一链第一链3 3 5 5 引物引物cDNA第一链第一链3 5 引物引物 降解降解mRNA模板模板或或RNaseH碱碱 剩下的剩下的cDNA单链的单链的3末端一般形成一个末端一