干扰素的制备及检定.docx

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1、干扰素的制备及检定(一)原理干抗素是干扰素诱生剂作用于有关生物细胞所产生的一类高活性、多功能蛋白质。它从细胞产生和释放出来以后，又作用于相应的其它同种细胞，使其获得抗病毒及抗肿瘤等多方面的免疫力。所谓干扰素诱生剂，是指能诱导有关生物细胞产生干扰素的一类物质。能诱导有关生物细胞产生。和B干扰素者称甲类干扰素诱生剂，如各种动物病毒、细胞内寄生的微生物等；可诱导细胞产生干扰素的称为乙类干扰素诱生剂，如脂多糖、链球菌毒素、肠毒素A等。在实际工作中，制备干扰素多采用两种方法。一是用干扰素诱生剂诱导某些生物细胞产生干扰素，经提取纯化并检定合格后即可使用。该法所用的细胞多为外周血白细胞。二是采用基因工程法进

2、行生产，即将干扰素基因导入大肠杆菌内，通过培养大肠杆菌来生产干扰素。目前，大规模生产干扰素主要采用基因工程法。下面仅以用干扰素诱生剂制备人白细胞干扰素为例介绍干扰素的制备方法。(-)材料和方法1材料细胞培养设备(如培养瓶、多孔培养板、温箱、显微镜、旋转培养器等)、水浴箱等。2方法(1)制备诱生剂：采用NDVF系弱毒株，以鸡胚尿囊液形式保存于一20,其血凝滴度稳定在1:640-1:1280之间。大量繁殖时，用05%水解乳蛋白稀释1001OOo倍，接种于9日龄鸡胚尿囊腔，置37。C培养72h后，收获尿囊液，效价测定应大于1:640,无菌检查应合格（2）制备诱生细胞：无菌采取人外周血（多用人脐带血，

3、或血库贮藏血），置于含肝素（抗凝血）的无菌瓶内，于4。C保存不超过24h,诱生细胞（白细胞）不单独提取，以全血代替。（3）制备粗制干扰素：加诱生剂,按1ml抗凝全血加0.2ml诱生剂（即NDVF系尿囊液,其血凝滴度不低于1:640）；加温吸附，将加有诱生剂的抗凝全血置37。C水浴中1h,每隔15min晃动一次，使NDVF吸附于白细胞上。然后以IOoOrmin离心20min,弃上清，留沉淀物；加营养液孵育诱生，按抗凝全血的12倍量加EagIe营养液于上述沉淀物中，混匀，置3536C温箱内旋转培养1820h;离心及酸处理，将上述培养物以2000rmin离心30min,取上清，以6molL盐酸将其P

4、H值调至20,置4冰箱5天灭活NDV；中性化,经5天酸化后,再用6molL氢氧化钠将PH值调至7274,即为粗制干扰素。（4）制备精品干扰素：KCNS沉淀，取上述粗制干扰素，力口KCNS并用2molLHCl调PH值为35,然后以2000rmin离心30min取沉淀;酒精提取，将沉淀溶于95%酒精(预冷至-20),用2molLNaOH调PH值为42,以2000rmin离心30min取上清；用2molLHCl调PH值至35,离心后取上清，再将PH值调至5.6,离心后取上清，最后将PH值调至71,离心后取沉淀；过碘酸钠沉淀，将沉淀溶于PBS中，加过碘酸钠，并调PH值为45用50%乙醇10倍稀释，离心

5、后取上清，将上清液对03molL(NH4)2CO3(PH值76)在4下透析过夜。sephacrylS200柱层析：将SephacrylS200按要求处理后装柱(45100Cm柱)，用PBS平衡后，加样(即上述上清液)，用洗液洗脱。洗脱期间用核酸蛋白仪连续检测，收集相应峰即为精制干扰素。取样进行效价测定，按结果进行稀释，分装并冻干。(三)检定1效价测定(1)制备攻击病毒：将水泡性口炎病毒(VSV)在鸡胚成纤维母细胞上传代后，再在猪细胞(旧RS)上传35代，使其对旧RS有良好致病效应，其TCID50应稳定(一般在10-610-7之间)。(2)准备测定细胞：生长良好的幼龄旧RS单层细胞。(3)测定：

6、取上述单层细胞分为若干组，每组加不同稀释度的干扰素，置37孵育2024h，然后每管均用10O个TCID50的VSV攻击，置374872h孵育后，观察结果。同时设细胞对照组和病毒对照组。病毒对照组CPE75%,正常细胞对照组CPE=0,即认为该测定系统有效。干扰素判定标准是以能保护半数细胞免受攻击病毒损害的干扰素最高稀释度的倒数作为干扰素的单位。2酸碱度测定取本品10支，加水溶解，精密测量PH值应为675o3水分测定按磺硫溶液法测定，不得超过3%。4安全试验取本品加水溶解，小鼠尾静脉注射，48h内不得有死亡。5热原检查取本品1支，加水溶解，依法检查，应符合规定。6菌检取本品3支，无菌水溶解，分别

7、接种到检查需氧菌、厌氧菌及霉菌用培养基上，37培养1周，应无菌生长。7超敏反应取健康豚鼠6只，每只腹腔注射本品适量,连续3次，于20天后再于耳静泳注入本品适量，应无过敏反应现象发生。（四）注意事项1制备NDVF系弱毒诱生剂时，种毒应无菌检查合格，且滴度在1：640以上。收毒时，应将污染的鸡胚弃去。2不必从血液中将白细胞提取出来，因红细胞对白细胞产生干扰素有营养作用。纯化的白细胞产生干扰素效价不一定高。3酸化的目的是杀死其中的诱生剂NDV,而在PH值20时，干扰素是稳定的。4在常温下干扰素半衰期很短。故各种操作要在低温环境下进行，动作要迅速，纯化所用试剂要作预冷处理。干扰素粗品及精品要及时置低温

8、下存放。效价测定时，干扰素应于临用时现溶解。白细胞介素2的制备及检定优尔生门户网站2009-10-257:38:09作者：优尔生白细胞介素2的制备及检定(一)原理白细胞介素2(IL2)是Th细胞受有丝分裂原或特异性抗原刺激后，并在白细胞介素1的辅助下，产生的一种可溶性糖蛋白。IL2是体内重要的广谱免疫增强因子，临床上常用于治疗免疫缺陷病及肿瘤等。(-)材料和方法1制备粗制IL2无菌采血，肝素抗凝，用RPMH640按1:1将血液稀释，然后重层于菲可液面上，以1500rmin离心30min,取白细胞层,用RPMI1640洗2次,按13x106细胞/ml浓度加入10%胎牛血清RPMII640,注入一

9、装有磁棒的大瓶中，置37搅拌培养4天，取出，分装于50ml离心管中，1500rmin离心20min,弃上清液，将细胞悬浮于1%胎牛血清RPMlI640培养液中，使细胞浓度为106细胞/ml。同时加入纯质PHA1-2gml以及多种B淋巴母细胞株，使其浓度为106细胞/ml,37。(:搅拌培养1824h后，取出以1500rmin离心30min,取上清，用045g滤膜过滤除菌，滤液即为粗制IL2。2制备精品IL2(1)硫酸镂沉淀与真空浓缩透析：在4下将硫酸核粉末按50%饱和量加入上述粗制IL2中，搅拌2h,120OOg离心30min,取上清液，再加入80%饱和硫酸筱，4C过夜，次日以12000g离心

10、30min,弃上清液，将沉淀溶于01%PEG6000的1:2PBS溶液(PH值73)中，置真空负压浓缩透析器中透析浓缩至所需容量。(2) SephadexG100凝胶过滤：用2180cm的过滤柱及PBS上)，以80mlh流速过滤。将各管洗脱液用紫外分光光度计28Onm检测其OD值。同时将几种不同分子量的标准蛋白也用相同条件过滤及检测其OD值，绘出IL2及标准蛋白OD值的曲线。将各管洗脱液过滤除菌后，作白细胞生物活性试验，按试验结果绘出曲线，找出具有最高IL2活性的儿管洗脱液，混合后，作下一步精制。(3) BIUeSePharoSe层析：将上述混合后的洗脱液加入BIueSepharosett,流

11、速约15mlh,按每管IOml收集流出液,当样品全部流出柱中以后，用上述PBS洗涤样品柱，再用梯度NaCl溶液(从0075molL至06molLNaCI的PBS溶液)洗脱，按2ml管收集洗脱液。NaCI溶液梯度及流速均由梯度混合器调节控制。洗脱完毕后，作各管OD值及NaCl浓度的测定。各管洗脱液过滤除菌后，作出生物活性测定。将峰值前后的数管洗脱液混合,即为精制的L20置一20。C冰箱保存。（三）检定1活性测定用10%胎牛血清RPMI1640将上述IL2稀释为50%、25%、125%、625%,而后再将每个百分浓度以及100%浓度的IL2倍比稀释，自1:2至1:128,将每个稀释度分别加入多孔板

12、的孔中，每孔OlmI。然后取CT6细胞株（小鼠的IL2依赖性T细胞株），调整浓度为106细胞/ml,每孔加入OImI,同时用培养基代替IL2作对照。将多孔板培养24h后，取出按每孔1ci的浓度加H3标记胸腺喀咤核昔继续培养4h。取出后用MESHn细胞收集器过滤洗涤细胞,用B计数器测定各孔细胞的cpm。必要时按此结果绘出曲线，确定活性单位。2蛋白含量测定采用分光光度计，分别测得OD280及OD260,然后按下式计算：蛋白含量（mgml）=（144OD280-075OD260）稀释倍数3毒性试验及细菌检查参考胸腺肽制备部分。（四）注意事项IL2的制备过程类似细胞培养的过程，因此，其注意事项也类似细胞培养。IL2活性测定采用的是同位素掺入法，因此须按要求操作，防止同位素扩散和污染。