日立l8900氨基酸自动分析仪.ppt.ppt

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1、日立日立 L-8900 氨基酸自动分析仪氨基酸自动分析仪l内容内容l氨基酸相关内容介绍氨基酸相关内容介绍l氨基酸分析仪发展及生产厂家氨基酸分析仪发展及生产厂家l氨基酸分析仪原理及相应部件氨基酸分析仪原理及相应部件l样品的制备样品的制备l应用应用l常见故障的分析与处理常见故障的分析与处理l保养保养一一 氨基酸相关内容介绍氨基酸相关内容介绍l 氨基酸（氨基酸（amino acid）：含有氨基和羧基的一类有机化合物的通）：含有氨基和羧基的一类有机化合物的通称。是生物功能大分子蛋白质的基本组成单位，是构成动物营养称。是生物功能大分子蛋白质的基本组成单位，是构成动物营养所需蛋白质的基本物质。所需蛋白质的

2、基本物质。l含有碱性氨基和酸性羧基的有机化合物含有碱性氨基和酸性羧基的有机化合物l氨基连在氨基连在-碳上的为碳上的为-氨基酸氨基酸l组成蛋白质的氨基酸均为组成蛋白质的氨基酸均为-氨基酸氨基酸组成蛋白质的组成蛋白质的 20 种氨基酸除甘氨酸外，都有一个不对称碳原子，即种氨基酸除甘氨酸外，都有一个不对称碳原子，即-碳原子。碳原子。-碳原子有四个不同取代基：羧基、氨基、氢原子和碳原子有四个不同取代基：羧基、氨基、氢原子和 R 基团，不同氨基酸的基团，不同氨基酸的 R 基团不同。基团不同。每种氨基酸有每种氨基酸有 D-构型和构型和 L-构型，天然蛋白质中的氨基酸都是构型，天然蛋白质中的氨基酸都是 L-

3、构型。构型。广泛存在于食品、药品、水产品、饲料和体液（血液、尿样）广泛存在于食品、药品、水产品、饲料和体液（血液、尿样）氨基酸在溶液中受溶液氨基酸在溶液中受溶液 pH 的影响存在着下列平衡的影响存在着下列平衡等电点（等电点（pI）：在某一）：在某一 pH 的溶液中，氨基酸解离成阳离子和阴的溶液中，氨基酸解离成阳离子和阴离子的趋势或程度相等，成为兼性离子，呈电中性，此时溶液离子的趋势或程度相等，成为兼性离子，呈电中性，此时溶液的的pH成为该氨基酸的等电点。成为该氨基酸的等电点。不同氨基酸等电点不同氨基酸等电点l丙氨酸丙氨酸 Ala（A）6.02 精氨酸精氨酸 Arg（R）10.76l天冬酰胺天冬

4、酰胺 Asn（N）5.41 天冬氨酸天冬氨酸 Asp（D）2.98l半胱酰酸半胱酰酸 Cys （C）5.02 谷氨酸谷氨酸 Glu（E）3.22l谷氨酰胺谷氨酰胺 Gln （O）5.65 甘氨酸甘氨酸 Gly（G）5.97l组氨酸组氨酸 His （H）7.58 亮氨酸亮氨酸 Leu （L）5.98l赖氨酸赖氨酸 Lys （K）9.74 蛋氨酸蛋氨酸 Met （M）5.75l苯丙氨酸苯丙氨酸 Phe （F）5.48 脯氨酸脯氨酸 Pro （P）6.30l丝氨酸丝氨酸 Ser（S）5.68 苏氨酸苏氨酸 Thr（T）6.53l色氨酸色氨酸 Trp（W）5.88 酪氨酸酪氨酸 Tyr （Y）5.65

5、l缬氨酸缬氨酸 Val（V）5.97 异亮氨酸异亮氨酸 Ile（I）6.02氨基酸的化学性质氨基酸的化学性质l氨基酸分子中都具有氨基和羧基，因此它们都能产生氨基与氨基酸分子中都具有氨基和羧基，因此它们都能产生氨基与羧基的一般反应，如脂化、甲基化、乙酰化以及酸碱的中和羧基的一般反应，如脂化、甲基化、乙酰化以及酸碱的中和作用等。有些氨基酸由于存在其它基团而产生特殊反应，如作用等。有些氨基酸由于存在其它基团而产生特殊反应，如半胱氨酸的巯基（半胱氨酸的巯基（-SH）茚三酮反应茚三酮反应茚三酮溶液与氨基酸共热，生成氨。氨与茚三酮和还原性茚三酮茚三酮溶液与氨基酸共热，生成氨。氨与茚三酮和还原性茚三酮反应，

6、生成紫色化合物。该化合物颜色的深浅与氨基酸的含量成反应，生成紫色化合物。该化合物颜色的深浅与氨基酸的含量成正比，可通过测定正比，可通过测定570nm处的光密度，测定氨基酸的含量。处的光密度，测定氨基酸的含量。l氨基酸的分离分析氨基酸的分离分析l特殊沉淀法特殊沉淀法l离子交换法离子交换法l萃取法萃取法l毛细电渗析毛细电渗析l离子交换法分离分析氨基酸的原理离子交换法分离分析氨基酸的原理l根据氨基酸是两性电解质这一特性，以及目的氨基酸与根据氨基酸是两性电解质这一特性，以及目的氨基酸与杂质氨基酸杂质氨基酸 pK、pI 值值的差异，利用离子交换树脂对各的差异，利用离子交换树脂对各种氨基酸吸附能力的不同进

7、行分离纯化。种氨基酸吸附能力的不同进行分离纯化。l氨基酸分析仪进入国内市场已有近三十年的历史，它是专用于氨基酸分析仪进入国内市场已有近三十年的历史，它是专用于测定蛋白质水解液（水解氨基酸）及生理体液中（游离氨基酸）测定蛋白质水解液（水解氨基酸）及生理体液中（游离氨基酸）混合氨基酸含量的一种专用仪器，现已广泛应用于各行各业。混合氨基酸含量的一种专用仪器，现已广泛应用于各行各业。它与其他分析仪器区别在于它与其他分析仪器区别在于只能检测氨基酸只能检测氨基酸，不能作为他用，不能作为他用，具有专一性。具有专一性。l1958年年 stein 与与moore 两人先后独立发明离子交换分离、茚三两人先后独立发

8、明离子交换分离、茚三酮柱后衍生氨基酸自动分析仪。基于阳离子交换柱分离、柱后酮柱后衍生氨基酸自动分析仪。基于阳离子交换柱分离、柱后茚三酮衍生、光度法测定的离子交换色谱法（茚三酮衍生、光度法测定的离子交换色谱法（IEC），），1972年年stein 与与moore 两人同获诺贝尔奖。两人同获诺贝尔奖。IEC是当今国际标准和国是当今国际标准和国家标准以及仲裁和涉外的方法家标准以及仲裁和涉外的方法。二 氨基酸分析仪发展及生产厂家氨基酸分析仪发展及生产厂家氨基酸分析仪生产厂家及常见型号氨基酸分析仪生产厂家及常见型号日立氨基酸分析仪发展历史日立氨基酸分析仪发展历史三三 氨基酸分析仪原理及相应部件氨基酸分析

9、仪原理及相应部件l氨基酸分析仪基本分析原理：氨基酸分析仪基本分析原理：l各种蛋白质是由各种蛋白质是由20种氨基酸首尾相连，并以一定的顺序组成肽链。用种氨基酸首尾相连，并以一定的顺序组成肽链。用水解的方法将肽链打开，形成单一的氨基酸进行分析。所有的氨基酸水解的方法将肽链打开，形成单一的氨基酸进行分析。所有的氨基酸在低在低pH值的条件下都带有正电荷，在阳离子交换树脂上均被吸附，但值的条件下都带有正电荷，在阳离子交换树脂上均被吸附，但吸附的程度不同，碱性氨基酸结合力最强、其次为芳香族氨基酸、中吸附的程度不同，碱性氨基酸结合力最强、其次为芳香族氨基酸、中性氨基酸、酸性氨基酸结合力最弱。按照氨基酸分析仪

10、设定的洗脱程性氨基酸、酸性氨基酸结合力最弱。按照氨基酸分析仪设定的洗脱程序，用不同离子强度、序，用不同离子强度、pH值的缓冲液依次将氨基酸按吸附力的不同洗值的缓冲液依次将氨基酸按吸附力的不同洗脱下来（先酸性氨基酸再中性氨基酸最后碱性氨基酸），被洗脱下来脱下来（先酸性氨基酸再中性氨基酸最后碱性氨基酸），被洗脱下来的氨基酸与茚三酮反应液在加热的条件下反应（的氨基酸与茚三酮反应液在加热的条件下反应（135度），生成可在分度），生成可在分光光度计中光光度计中570nm和和440nm检测到的蓝紫色物质（仲氨生成浅黄色物检测到的蓝紫色物质（仲氨生成浅黄色物质质440nm检测），外标法定量。检测），外标法定

11、量。l1.氨基酸在氨基酸在pH 2.2的条件下都带正电荷，在阳离子交换树脂上均被吸附，的条件下都带正电荷，在阳离子交换树脂上均被吸附，但结合强度各不相同。但结合强度各不相同。l2.随着缓冲液在离子交换柱上流动，氨基酸不断的被吸附、解吸附。由于随着缓冲液在离子交换柱上流动，氨基酸不断的被吸附、解吸附。由于氨基酸性质的差异（酸碱性、极性、分子大小），吸附强度有差异。氨基酸性质的差异（酸碱性、极性、分子大小），吸附强度有差异。l3.不同氨基酸与离子交换树脂的亲和力不同：碱性氨基酸芳香族氨基酸不同氨基酸与离子交换树脂的亲和力不同：碱性氨基酸芳香族氨基酸中性氨基酸酸性氨基酸及羟基氨基酸。中性氨基酸酸性氨

12、基酸及羟基氨基酸。l4.提高流动相提高流动相pH值，氨基酸正电荷减少，吸附力减弱，最后从离子交换柱值，氨基酸正电荷减少，吸附力减弱，最后从离子交换柱上洗脱下来，洗脱顺序是酸性和带羟基氨基酸、中性氨基酸、碱性氨基酸。上洗脱下来，洗脱顺序是酸性和带羟基氨基酸、中性氨基酸、碱性氨基酸。l5.氨基酸标准溶液中各种氨基酸在氨基酸自动分析仪上被洗脱的顺序一定，氨基酸标准溶液中各种氨基酸在氨基酸自动分析仪上被洗脱的顺序一定，标准液各种氨基酸的浓度一定，洗脱峰的面积一定，由此可计算出样品中标准液各种氨基酸的浓度一定，洗脱峰的面积一定，由此可计算出样品中各种氨基酸的含量。各种氨基酸的含量。氨基酸分析仪洗脱过程氨

13、基酸分析仪洗脱过程l通常细分为两种系统：蛋白水解分析系统（钠盐系统）和游离氨基酸通常细分为两种系统：蛋白水解分析系统（钠盐系统）和游离氨基酸分析系统（锂盐系统），利用不同浓度和分析系统（锂盐系统），利用不同浓度和pH值的柠檬酸钠或柠檬酸值的柠檬酸钠或柠檬酸锂进行梯度洗脱。其中钠盐系统一次最多分析约锂进行梯度洗脱。其中钠盐系统一次最多分析约25种氨基酸，速度较种氨基酸，速度较快，基线平直度好；锂盐系统一次最多分析约快，基线平直度好；锂盐系统一次最多分析约50种氨基酸，速度较慢，种氨基酸，速度较慢，基线一般不如钠盐系统好。基线一般不如钠盐系统好。离子交换树脂离子交换树脂l专用氨基酸分析仪的色谱柱主

14、要是以磺酸型强酸性阳离子交换专用氨基酸分析仪的色谱柱主要是以磺酸型强酸性阳离子交换树脂为柱填料。强酸型阳离子交换树脂，它是由苯乙烯和二乙树脂为柱填料。强酸型阳离子交换树脂，它是由苯乙烯和二乙烯苯聚合而成的。该树脂是由苯乙烯和二乙烯基本聚合后磺化烯苯聚合而成的。该树脂是由苯乙烯和二乙烯基本聚合后磺化而成，球状树脂的粒度一般在而成，球状树脂的粒度一般在5-10m之间，交联度多为之间，交联度多为8%-12%。l交联度大，树脂的网状结构紧密，孔隙度小，对外界离子进入交联度大，树脂的网状结构紧密，孔隙度小，对外界离子进入树脂有阻碍作用，较大的离子根本不能进入树脂内部，这样就树脂有阻碍作用，较大的离子根本

15、不能进入树脂内部，这样就可以提高树脂对离子的选择性。交联度大的适合用于分子量较可以提高树脂对离子的选择性。交联度大的适合用于分子量较小的氨基酸分离；交联度小，树脂结构疏松，孔隙度大，适合小的氨基酸分离；交联度小，树脂结构疏松，孔隙度大，适合用于蛋白质、肽类的分离。用于蛋白质、肽类的分离。L-8900氨基酸分析仪内部结构氨基酸分析仪内部结构日立日立L-8900氨基酸分析仪的组成氨基酸分析仪的组成日立日立L-8900氨基酸分析仪分析原理氨基酸分析仪分析原理l1.样品中的氨基酸在低样品中的氨基酸在低pH的条件下，都带有正电荷，在阳离子的条件下，都带有正电荷，在阳离子交换树脂上均被吸附，但吸附的程度不

16、同，碱性氨基酸结合力交换树脂上均被吸附，但吸附的程度不同，碱性氨基酸结合力最强，其次为中性氨基酸、酸性氨基酸结合力最弱。最强，其次为中性氨基酸、酸性氨基酸结合力最弱。l2.按照氨基酸分析仪设定的洗脱程序，用不同离子强度、按照氨基酸分析仪设定的洗脱程序，用不同离子强度、pH值值的缓冲液依次将氨基酸按吸附力的不同洗脱下来。的缓冲液依次将氨基酸按吸附力的不同洗脱下来。l3.分离后的氨基酸与茚三酮试剂在高温反应器中进行衍生反应，分离后的氨基酸与茚三酮试剂在高温反应器中进行衍生反应，生成可以被分光光度计检测的有色物质，然后在检测器中被检生成可以被分光光度计检测的有色物质，然后在检测器中被检测出来。测出来。日立日立L-8900氨基酸分析仪氨基酸分析仪流程图流程图分析实例：啤酒酵母分析实例：啤酒酵母实例分析：猪排实例分析：猪排实例分析：正常血清实例分析：正常血清实例分析：苯丙酮尿症血清实例分析：苯丙酮尿症血清实例分析：苹果汁实例分析：苹果汁L-8900 氨基酸分析仪性能指标氨基酸分析仪性能指标以蛋白质水解液标准分析方法为例：以蛋白质水解液标准分析方法为例：净分析时间：净分析时间：30分钟分钟检出限：