标记抗体技术.ppt
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1、标记抗体技术标记抗体技术标记抗体技术是应用最为广泛的免疫血清学技标记抗体技术是应用最为广泛的免疫血清学技术,主要有以下术,主要有以下3 3大类。大类。v免疫荧光抗体技术免疫荧光抗体技术v免疫酶技术免疫酶技术v放射免疫分析放射免疫分析标记抗体标记抗体v为什么要进行标记抗体?为什么要进行标记抗体?v什么是二抗?什么是二抗?免疫酶标记技术v酶联免疫吸附试验酶联免疫吸附试验(Enzyme-Linked Immunosorbnent Assay Enzyme-Linked Immunosorbnent Assay,ELISAELISA)v免疫酶组织化学染色技术免疫酶组织化学染色技术v斑点斑点-酶联免疫吸
2、附试验酶联免疫吸附试验一一 原理原理v酶标抗体技术是根据抗原抗体反应的特异性酶标抗体技术是根据抗原抗体反应的特异性和酶催化反应的高敏感性而建立的起来的免和酶催化反应的高敏感性而建立的起来的免疫检测技术。疫检测技术。v免疫酶相关的免疫制备技术免疫酶相关的免疫制备技术抗体的制备抗体的制备标记用酶标记用酶抗体标记抗体标记vELISA:间接法,直接法,夹心法,竞争法间接法,直接法,夹心法,竞争法v免疫组化免疫组化vDot-ELISA免疫酶相关的免疫制备技术免疫酶相关的免疫制备技术免疫酶相关的免疫制备技术免疫酶相关的免疫制备技术v制备结合物时所用制备结合物时所用纯度较高的纯度较高的IgGIgG,以免在与
3、酶联,以免在与酶联结时其他杂蛋白的干扰。结时其他杂蛋白的干扰。v最好用层析纯化的抗体,这样全部酶结合物均具有最好用层析纯化的抗体,这样全部酶结合物均具有特异的免疫活性,可以在高稀释度进行反应,实验特异的免疫活性,可以在高稀释度进行反应,实验结果本底浅淡。结果本底浅淡。v在在ELISAELISA中用酶标抗原的模式不多,总的要求是中用酶标抗原的模式不多,总的要求是抗抗原必须是高纯度的原必须是高纯度的。Preparation of Polyclonal AntibodiesvPolyclonal antiserum is generated in animals(sheep,rabbits or g
4、oats)with the introduction of antigens into the animals bloodstream.vThe antiserum(serum from blood containing the desired antibodies)contains a mixture of antibodies,each of which may bind to different antigen binding sites(epitopes).vAntiserum contains a mixture of antibodies.vThis mixture of anti
5、bodies are called ployclonal antibodies.vAn antigen that has multiple sites for antibody binding is called a mutivalent antigen.Preparation of Monoclonal AntibodiesvMonoclonal antibodies are highly specific for a single epitope on a multivalent antigen.vThey are produced from a single cell line usin
6、g hybridoma technology and mouse myeloma cell lines.抗体纯化抗体纯化v沉淀法沉淀法硫酸铵盐析硫酸铵盐析辛酸法辛酸法v层析法层析法凝胶过滤层析凝胶过滤层析离子交换层析离子交换层析免疫亲和层析免疫亲和层析硫酸铵盐析v取取10 ml10 ml血清加血清加10 ml10 ml生理盐水,加生理盐水,加入入20 ml20 ml饱和硫酸铵,终浓度为饱和硫酸铵,终浓度为50%50%。44,3h3h以上,使其充分沉淀。以上,使其充分沉淀。v离心弃上清,以离心弃上清,以10 ml10 ml生理盐水溶解生理盐水溶解沉淀,再逐滴加饱和硫酸铵沉淀,再逐滴加饱和硫酸铵2
7、0ml20ml。置置43h43h以上以上.v重复上述第二步过程重复上述第二步过程1 12 2次。次。v末次离心后所得沉淀物为末次离心后所得沉淀物为-球蛋白,球蛋白,以以PBSPBS溶解至溶解至10ml10ml装入透析袋。装入透析袋。v对对PBSPBS充分透析、换液充分透析、换液3 3次,至萘氏次,至萘氏试剂测透析外液无黄色,即无试剂测透析外液无黄色,即无NHNH4 4+为止为止例:兔抗鸭IgG的提纯(辛酸硫酸铵沉淀法)沉淀溶解透析离心,取上清加辛酸分离鸭血清上清透析过夜加饱和硫酸铵44静置10h10h离心,取沉淀取出分装SDSSDSPAGEPAGE检测v实验结果 提纯的兔抗鸭IgG的SDS-P
8、AGE M:蛋白Marker 1:提纯的兔抗鸭IgG 2:兔血清v凝胶过滤层析凝胶过滤层析主要是根据主要是根据蛋白质蛋白质的的大小和形状,即蛋白大小和形状,即蛋白质的质量进行质的质量进行分离分离和和纯化。纯化。层析柱层析柱中的填中的填料是某些惰性的多孔料是某些惰性的多孔网状结构物质,多是网状结构物质,多是交联的聚糖交联的聚糖(如葡聚糖如葡聚糖或琼脂糖或琼脂糖)类物质,使类物质,使蛋白质混合物中的物蛋白质混合物中的物质按分子大小的不同质按分子大小的不同进行分离。进行分离。离子交换层析离子交换层析v是以离子交换剂为固定是以离子交换剂为固定相,依据流动相中的组相,依据流动相中的组分离子与交换剂上的平
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