脑缺血损伤及其体外细胞模型.ppt

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1、cerebral ischemia injury 脑梗塞：疾病相关介绍急性脑缺血级联反应体外细胞模型123脑卒中：全球第三位死因脑卒中：全球第三位死因缺血性卒中占卒中缺血性卒中占卒中86l 缺血性卒中中，又包括短暂脑缺血发作(TIA)、脑血栓、脑栓塞和腔隙性梗塞，后三者在临床上有时不易区分，故统称为脑梗塞。脑梗塞致残率第一、致死率第二脑梗塞致残率第一、致死率第二l 每年死于脑梗塞的病人达150万l 现有脑梗塞病人750万到800万人l 我国每年用于脑脑梗塞的直接经济支出已近300亿元每年全国新发病例每年全国新发病例250250万万脑部血液供应脑部血液供应l 脑部的血液供应主要来自两个系统：颈动

2、脉系统：大脑前动脉、中动脉、前脉络膜动脉、眼动脉 椎-基底动脉系统：左右椎动脉、基底动脉l 颈动脉系统：供应大脑半球前3/5部分l 椎-基底动脉系统：供应大脑半球后2/5部分脑梗塞：病因脑梗塞：病因临床表现：颈动脉系统血栓临床表现：颈动脉系统血栓l 大脑中动脉主干缺血：开始上肢完全性软瘫，下肢有时尚能活动。l 大脑中动脉深支血栓：表现为持久的偏瘫。l 大脑中动脉上组皮质支血栓：有时对侧力弱，面部及上肢的感觉障碍。l 大脑中动脉下组皮质支硬塞：优势半球病变，感觉性失语、失读症、失算症及命名性失语，可有对侧偏盲；非优势半球病变，失认症，对自己形象歪曲或不能辨认，否认自己有神经系统疾病。临床表现：椎

3、临床表现：椎-基底动脉系统血栓基底动脉系统血栓l 眩晕、头痛；l 眼球震颤、复视、同向偏盲、皮层性失明、眼肌麻痹；l 吞咽困难，构音障碍；l 交叉性麻痹及感觉减退；l 四肢瘫痪、共济失调；l 可有不同程度的意识障碍。脑梗塞按栓子来源分类脑梗塞按栓子来源分类l 心源性：占60%75%,栓子主要来源是风湿性心瓣膜病、心内膜炎赘生物及附壁血栓脱落等，以及心肌梗死、心房粘液瘤、心脏手术、心脏导管、二尖瓣脱垂和钙化，先天性房室间隔缺损等。l 非心源性：如动脉粥样硬化斑块脱落、肺静脉血栓或凝块、骨折或手术时脂肪栓和气栓、血管内治疗时血凝块或血栓脱落等;颈动脉纤维肌肉发育不良(女性多见);肺感染、败血症、肾

4、病综合征的高凝状态等可引起脑栓塞。l 来源不明：约30%的脑栓塞。脑梗塞易发人群脑梗塞易发人群脑梗塞临床治疗方法脑梗塞临床治疗方法3-6小时6-48小时急性脑缺血级联反应急性脑缺血级联反应l 在正常生理状态下，成人每100 g脑组织血流量约为50 mlmin。l 当脑血流量处于或低于20 ml时，缺血所致的级联反应开始被激活，出现不可逆性组织坏死，即脑梗死。急性脑缺血级联反应包括急性脑缺血级联反应包括能量耗竭能量耗竭兴奋毒性兴奋毒性细胞内细胞内钙超载钙超载自由基过度自由基过度形成形成神经神经细胞凋亡细胞凋亡炎症炎症BBB破坏破坏脑缺血级联反应脑缺血级联反应:能量耗竭能量耗竭l 能量耗竭：脑占体

5、重23，但需要的血液供应却占心排出量的20。l 脑细胞不能将脂肪、蛋白质或葡萄糖以外的碳水化合物作为能量来源，只能直接利用葡萄糖。脑缺血后，脑组织氧糖缺乏，发生能量障碍。l 脑血供停止68s，脑电活动即消失；30s神经代谢细胞代谢开始受累；2min神经细胞代谢停止；5min神经细胞开始死亡，大脑皮质开始出现永久性损害。缺血半暗带缺血半暗带脑缺血级联反应脑缺血级联反应:细胞内钙超载细胞内钙超载l 细胞内钙超载：能量代谢障碍直接抑制细胞质膜上Na+-K+-ATP酶活性，使大量K+内流，神经元去极化，电压依赖性与配体门控性Ca2+通道激活，大量Ca2+内流。脑缺血级联反应：兴奋毒性脑缺血级联反应：兴

6、奋毒性l 兴奋毒性：谷氨酸(Glu)是中枢神经系统(CNS)主要的兴奋性神经递质，也是细胞通讯传递、生长、分化和可塑性的重要调质，同时又是一个很强的神经毒素，生理条件下，由于体内高效能的谷氨酸摄取系统的存在，使细胞外Glu维持在较低的水平，仅有少量作为兴奋性神经递质参与信号传递，但在脑缺血时，Glu大量释放和对谷氨酸受体(GluRs)过度刺激，导致神经元兴奋、溃变、死亡，产生兴奋性毒性。脑缺血级联反应：自由基过度形成脑缺血级联反应：自由基过度形成l 在正常脑组织中，活性氧自由基(reactive oxygen species,ROS)是通过内源性酶抗氧化防御系统，如超氧化物歧化酶(supero

7、xide dismutase,SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase，GPX)、过氧化氢酶(catalase,CAT)与非酶抗氧化防御系统，如谷胱甘肽(glutathione,GSH)、维生素C、E等来维持平衡。自由基蓄积过多，攻击机体，即为氧化应激。自由基过度形成自由基过度形成自由基过度形成自由基过度形成l NADPH氧化酶首先发现于中性粒细胞和巨噬细胞，是由gp91 Phox，p22Phox，p47Phox，P67 Phox，p40Phox和Rac六种亚基组成的复合体。gp91 Phox 是其主要的功能亚基即催化亚基。l 脑缺血后，NOX2的活化通过一些

8、激酶如蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)等，电子由NADPH氧化酶转移至O2，产生超氧阴离子(O2-)。2O2+NADPH 2O2-+NADP+H+脑缺血级联反应：炎症脑缺血级联反应：炎症and BBB破坏破坏l 炎症and血脑屏障被破坏:脑缺血一再灌注时，氧自由基及其他信使激活炎性细胞因子，释放趋化因子，上调黏附分子，在白细胞和内皮细胞的相互作用下，白细胞黏附于血管内皮细胞，从而阻塞微血管，导致微血管闭塞而引发“无复流现象”，聚集的白细胞能够释放氧自由基，蛋白水解酶等直接损伤内皮细胞，破坏血-脑屏障，从而产生脑水肿，造成脑出血和神经元的损伤。同时，激活的白细胞在微血管内聚

9、集，释放大量的炎性介质和细胞因子，使更多的中性粒细胞聚集到炎性反应部位，从而加重炎性反应，造成恶性循环。脑缺血级联反应脑缺血级联反应:神经细胞凋亡神经细胞凋亡脑缺血诱导细胞凋亡两步脑缺血诱导细胞凋亡两步：l 脑缺血时，Glu浓度升高所产生的早期兴奋毒性主要通过KA受体和AMPA受体。l 由NMDA受体介导的神经元迟发性损伤，可在数小时至数日发生，以细胞内钙超载为特征。脑缺血体外细胞实验脑缺血体外细胞实验神经元模型神经元模型胶质细胞模型胶质细胞模型内皮细胞模型内皮细胞模型共培养模型共培养模型缺血模型缺血模型细胞模型细胞模型神经元与胶质细神经元与胶质细胞共培养胞共培养 BBB模型模型脑片模型脑片模

10、型直接诱导法直接诱导法间接诱导法间接诱导法细胞模型细胞模型神经元模型神经元模型1.原代神经元培养：多采用1518 d孕龄的胎鼠或新生鼠，经取材、机械分离、酶消化等步骤获得细胞悬液，接种至包被多聚赖氨酸的培养皿内，用添加B27的Neurobasal(NB)无血清培养基培养，并用阿糖胞苷抑制胶质细胞生长，可获得纯度较高的原代培养神经元，培养57 d后用于实验。由于海马对缺氧较为敏感，因此常从海马组织中分离原代神经元用于研究。2.传代细胞系：如小鼠来源的Neuro-2a细胞和NG108-15细胞、大鼠来源的B104细胞、PC12细胞、人来源的SH-SY5Y细胞等。细胞模型细胞模型胶质细胞模型胶质细胞

11、模型1.原代胶质细胞培养：胶质细胞原代培养的取材过程与神经元原代培养类同，只是培养时换成利于胶质细胞生长的DMEMF12完全培养基(含10胎牛血清)，体外培养l012 d后细胞融合并分层：上层主要为小胶质细胞，下层主要为星形胶质细胞。然后，可采用多种方法进一步纯化。2.传代的胶质细胞系:小鼠胶质细胞系(BV2细胞、N9细胞、C8-B4细胞)、大鼠胶质细胞系C6细胞以及人星形胶质细胞U251.细胞模型细胞模型内皮细胞模型内皮细胞模型1.原代内皮细胞培养：一般从成年动物大脑皮质取材，剪刀破碎成1 mm 大小，胶原酶消化后，经密度梯度离心或过筛方法获得，然后接种至型胶原包被的培养板内，培养45 d后

12、融合形成紧密连接的单层细胞。内皮细胞单层或由内皮细胞层构成的体外BBB模型，经OGD诱导缺血后，内皮细胞问紧密连接遭到破坏，通透性增加，跨内皮电阻(transendothelial electrical resistance，TEER)减小，与体内状态相似。细胞共培养模型：神经元与胶质细胞共培养细胞共培养模型：神经元与胶质细胞共培养利用胶质细胞滋养层进行分离式原代神经元培养的方法。又称细胞培养小室或Transwel小室，分别将纯化的胶质细胞和神经元接种于插入式培养皿的微孔膜和6孔板内的盖玻片爬片上。混合培养混合培养类似原代培养神经元的获取和培养过程，只是培养基中不添加阿糖胞苷，但添加5胎牛血清

13、。神经元和胶质细胞共同生长在一个培养层。Banker共培养共培养插入式培养皿插入式培养皿细胞共培养模型：细胞共培养模型：BBB模型模型l 来源于成年鼠的BMEC与来源于新生鼠的胶质细胞共培养：BMEC在半透膜上进行单层培养，胶质细胞在半透膜下的培养孔中生长。通过检测TEER(transendothelial electrical resistance，跨内皮电阻）和内皮通透系数(endothelial permeability coeficient，Pe)来监测内皮细胞功能，检测闭锁小带蛋白1和闭合蛋白这2种参与内皮细胞紧密连接的重要蛋白，可反映内皮细胞结构的完整性。虽然该模型中内皮细胞的TE

14、ER和Pe相对低于体内状态，但具有与体内状态一样的细胞特性。细胞共培养模型：脑片模型细胞共培养模型：脑片模型l 脑片多来源于出生后68 d的大鼠，也可采用未成年或成年大鼠。最常用的是海马组织，因为其解剖学结构明确而且对缺血性损伤最为敏感。l 相对于原代培养神经细胞，脑片可在体外培养数周时间，能保留体内状态下细胞间的相互作用和三维立体结构，具有正常和完整的突触通路、递质传递和电生理等功能。同时，脑片培养排除了体内模型中BBB的干扰，可采用人工培养基或添加各种药物，易于控制培养环境。脑片模型脑片模型脑片培养方法脑片培养方法A：旋转管法B：半透明膜法缺血模型：直接诱导法缺血模型：直接诱导法OGDOG

15、D化学药物化学药物OGD是使用低氧装置(如三气培养箱)结合无糖培养基或是向无糖培养基中持续通人不含氧的混合气体(5CO2+95N2)来模拟缺糖缺氧环境。经OGD处理一段时间后，可转移到正常氧浓度和含糖培养基条件下继续培养，以模拟细胞或组织缺血再灌注损伤的病理生理学过程。叠氮化钠、氰化钠等氧化代谢抑制剂能通过与细胞色素氧化酶紧密结合来抑制氧化磷酸化过程和阻止线粒体产生ATP。三气培养箱三气培养箱缺血模型：间接诱导法缺血模型：间接诱导法兴奋性毒性损伤模型兴奋性毒性损伤模型氧化应激性损伤氧化应激性损伤一般采用谷氨酸或谷氨酸盐和NMDA等试剂。100mol/L 的谷氨酸盐作用于皮质神经元5 min即可

16、造成大量损伤。主要采用过氧化氢或叔丁基过氧化氢可模拟脑缺血和缺血再灌注产生的活性氧(超氧阴离子、过氧化氢、羟自由基等)所引起的氧化应激损伤。但是，目前对于其使用浓度和作用时间尚缺乏统一标准，这些活性氧与培养物类型和培养条件有关。缺血模型：间接诱导法缺血模型：间接诱导法一氧化氮一氧化氮(nitric oxide(nitric oxide，NO)NO)损伤损伤炎症反应炎症反应NO具有神经保护和神经毒性双重作用。硝普钠(sodium nitroprusside，SNP)可用作外源性NO供体。对于体外培养的小胶质细胞或脑组织，可给予脂多糖诱导小胶质细胞活化，从而产生多种炎症效应：肿瘤坏死因子-(tumor necrosis facto-，TNF-)等炎性因子的释放，激活诱导型一氧化氮合酶合成NO，下调谷胱甘肽的表达等。也可直接给予外源性炎性因子，如TNF-.缺血模型：间接诱导法缺血模型：间接诱导法细胞凋亡细胞凋亡细胞凋亡脑缺血损伤级联反应的最下游事件。缺血半暗带或梗死区周围神经细胞凋亡是造成脑缺血继发性损伤的主要原因，但其具体机制尚不明确。抗凋亡将成为各种治疗药物研究的重要靶点。星状孢子素是常