成体干细胞.ppt

《成体干细胞.ppt》由会员分享，可在线阅读，更多相关《成体干细胞.ppt（31页珍藏版）》请在第壹文秘上搜索。

1、成体干细胞w 在个体的发育过程成体干细胞w 初期：一个细胞的命运在发育初期就已经被决定了，且不可逆转。w 现在：胚胎期干细胞和组织干细胞均具有多向分化潜能，不仅可以分化为相同胚层来源的组织细胞，而且可以分为不同胚层来源的组织细胞。成体干细胞的特性w（1）通常处于静息状态，分裂缓慢，在形态上表现为细胞体积小、胞内细胞器稀小、细胞内RNA含量低和组织结构中位置相对固定细胞周期长，具有自我更新与自我维持的能力w（2）具有多向分化的潜能w（3）分裂能力可维持相当长的时间，有的可持续终生w（4）既具有生理性的更新能力，也具有对损伤或疾病导致的反应与修复能力w（5）自我更新与分化需要特定的微环境，这个微环

2、境能够提供一些因子维持干细胞的未分化状态，并能将诱导干细胞发生分化的因子排斥在外。成体干细胞造血干细胞间充质干细胞神经干细胞角膜缘干细胞胰腺干细胞皮肤干细胞肠上皮干细胞 肝脏干细胞w 存在部位w 生物学特性w 分离培养w 诱导分化w 应用间充质干细胞 存在部位 骨髓间充质干细胞(bone marrow-derive Mesenchymal stem cells，骨髓MSCs)是骨髓内除造血干细胞(hematopoietic stem cells,HSC)之外的另一类干细胞,骨髓造血微环境的重要组成部分,在体内外均具有支持和调控造血的作用。因其比较容易贴壁和形成成纤维样的克隆,因此有的文献也把M

3、SCs称做成纤维细胞集落形成单位(Colony forming unit fibroblast,CFU-F)。又由于它们来自骨髓的支持结构,并作为滋养层支持造血干细胞的生长,因此也有人称其为骨髓基质干细胞(Bone marrow stromal cells,BMSCs)。生物学特性 1：形态特征 一般认为，在光学显微镜下，体外培养的MSC细胞体积小、呈梭型、三角型、多角型。扫描电镜分析表明，细胞表面有大量细长的微绒毛。透射电镜分析表明，细胞核质比高，核仁明显,胞浆中细胞器少。2：细胞表面标志 由于至今还未筛选到骨髓MSCs 特异性的表面标记分子，因此骨髓MSCs 的鉴定都是通过鉴定一些较为公认

4、的骨髓MSCs表面标记的表达情况，并结合体外诱导培养过程中出现的分化表型,然后推测得知是否为骨髓MSCs。w A:不表达分化相关的细胞标志如I,II、III型胶原及碱性磷酸酶或ostepontin,也不表达造血干细胞的表面标志，如脂多糖受体CD34、CD14以及白细胞表面抗原CD45等，w B:但表达SH2、SH3、CD29、CD71、CD90、CD106、CD120a、CD124、CD166和多种表面蛋白图1-8 核质比高，细胞器少的细胞 25 000图1-9 核质比较低，细胞器丰富的细胞 25 000分离培养w 采集部位：骨盆髂骨上嵴、胫骨和股骨的骨髓腔、胸骨和腰椎突。w 分离方法w 1

5、细胞帖壁筛选法 血细胞由于不贴壁，可随着换液除去。贴壁细胞呈纤维细胞样形态，并逐渐形成单层纤维细胞集落，这种贴壁细胞被认为是骨髓MSCs。由于此法简单易行，已被广泛采用。w 2 密度梯度离心法 主要根据骨髓MSCs与其他细胞的比重不同来实现分离。w 3 细胞表面分子标记分选法 主要是根据骨髓MSCs的细胞表面分子特征来分离。一般采用流式细胞仪、免疫磁珠或免疫沉积法来进行分选。w 4 细胞筛筛选法 主要是根据细胞大小来实现分离 间充质干细胞分化成骨细胞 在MSCs培养体系中加入地塞米松、地塞米松、-磷酸甘油和抗坏血酸磷酸甘油和抗坏血酸等单独或联合诱导,发现培养的MSCs逐渐形成聚集体或结节,碱性

6、磷酸酶活性也随之增高,基质钙化明显,可分化为成骨细胞。1,25-(OH)2-D3、透明质酸、骨形态形成蛋白-2(BMP-2)以及铜等均可促使MSCs 向成骨细胞分化。间充质干细胞分化向软骨细胞分化w 骨髓MSCs在一定地培养条件下，（1 1）三维培养方式；（）三维培养方式；（2 2）无）无血清培养基；（血清培养基；（3 3）添加转让生长因子）添加转让生长因子家族成员家族成员。在这些条件下，与地塞米松协同作用，细胞快速改变成纤维细胞样形态和启动软骨特异性细胞外基质成份的表达。TGF-1，2，3均能诱导该反应；然而TGF-2和TGF-3在促进软骨发生上比TGF-2更有效。在成人骨髓的MSCs培养体

7、系中加入地塞米松和TGF-3,在第14天时,在细胞外基质中检测到型胶原和 aggreca；在含10-7moL/L 地塞米松的培养基中培养,有、型胶原表达,w 用甲状腺素处理后,MSCs可进一步向肥大软骨细胞分化。间充质干细胞分化脂肪细胞分化w 骨髓MSCs在体外诱导因素的作用下,可定向分化为脂肪细胞。用异丁基异丁基-甲基黄嘌呤甲基黄嘌呤 （IBMXIBMX）、地塞米松、胰岛素和）、地塞米松、胰岛素和吲哚美辛吲哚美辛 （IMIM）联合诱导人的MSCs,可观察到细胞内逐渐聚集含脂质丰富的小泡,多种诱导处理可使95%以上的细胞定向分化为脂肪细胞,并且细胞内的脂质小泡不断地长大、融合,最终充满细胞。这

8、些分化的脂肪细胞在体外培养可健康生长至少3个月。间充质干细胞分化心肌细胞分化1 体外分化实验w Makino等从小鼠股骨中获得骨髓MSCs,经5 5氮胞苷氮胞苷处理,大约30%的MSCs 出现形态学改变,分化为类心肌细胞,并可重复检测到自主起搏细胞。间充质干细胞分化心肌细胞分化w（1)1 1周后分化细胞周后分化细胞,出现肌管样结构出现肌管样结构,2,2周后可见自主性搏动周后可见自主性搏动,3,3周后分化细胞同步起搏；周后分化细胞同步起搏；w(2)分化的MSCs表达出特异性的心房利钠肽利钠肽(ANP)(ANP)和脑利钠肽和脑利钠肽(BNP)(BNP)基因基因,并且能与抗肌球蛋白、抗支架蛋白、抗肌

9、纤维蛋白的相应抗体结合。表明分化的细胞含有类心肌收缩蛋白,完全不同于平滑肌细胞及骨骼肌细胞；w(3)电镜检查电镜检查类心肌细胞的超微结构时可观察到:特征性的经闰盘连接的肌节、中心核和心房颗粒；w(4)5氮胞苷处理25周后，分化的分化的MSCsMSCs电生理检测到至少有电生理检测到至少有2 2 种完全不同的动作电位种完全不同的动作电位：类窦房结AP 及类心室AP。Fukuda也得出相似结果,并且对心肌收缩蛋白、肌球蛋白、-肌动蛋白进行分析,发现上述蛋白与胚胎心肌蛋白类似。因此，具有多向分化潜能的骨髓MSCs可作为心肌细胞重建术的细胞来源。间充质干细胞分化心肌细胞分化2 体内分化w 由MSCs向类

10、心肌细胞分化过程中,除5氮胞苷外,体内心脏微环境对MSCs的分化也至关重要。Wang等在其实验中提及心肌微环境可以支持MSCs移植后的生长和向心肌细胞分化。w “环境依赖性分化”（milieu-dependent differentiation）内容：认为生长因子、细胞因子、细胞外基质等以及它们在干细胞/宿主细胞之间的相互作用，在诱导MSCs向心肌分化方面起着重要作用。w 尽管MSCs向心肌分化的具体机制不清楚，但一致倾向认为:组织损伤和高水平的多能细胞是其分化的两个重要的决定因素。间充质干细胞分化心肌细胞分化wOrlicOrlic等等认为干细胞迁移认为干细胞迁移、分化分化、增殖的信号来自心室

11、壁坏死区的损伤增殖的信号来自心室壁坏死区的损伤心肌心肌，并提出如下的心肌再生可能机制并提出如下的心肌再生可能机制:间充质干细胞分化向肌肉细胞分化 w 体外诱导w 从大鼠骨髓中分离出MSCs,在培养的第二代MSCs中加入5氮胞苷,711天后,可观察到MSCs分化成肌肉母细胞和多核肌管肌肉母细胞和多核肌管,也可在细胞的细胞质中观察到苏丹黑阳性小滴。用10mol/L5氮胞苷诱导小鼠MSCs 1416后可见有肌管样细胞出现w Phinney等发现两性霉素B，诱导小鼠MSCs分化形成多核肌管样纤维。w 体内诱导w 国内学者将培养的人骨髓MSCs注入裸鼠皮下,经过1个月的生长,在注射局部出现了由人MSCs

12、分化形成的骨骼肌结构,而且通过免疫组织化学染色显示骨骼肌纤维呈小鼠抗人actin阳性,证明这些骨骼肌纤维是人MSCs分化而来的,而非裸鼠自身的骨骼肌；间充质干细胞分化向神经细胞分化w 在丁化羟基苯甲醚丁化羟基苯甲醚(BHA)(BHA)或或-巯基乙醇巯基乙醇（-mercaptoethanol，-Me）作用下,可诱导大鼠骨髓基质细胞向神经细胞分化w 用双丁酰环磷腺苷(dbcAMP)和异丁基甲基黄嘌呤(IBMX)处理MSCs可诱导神经分化早期标记的表达w 在神经生长培养基中添加EGF和脑源性神经营养因子（BDNF）同样可诱导神经分化早期标记的表达。w 在bFGF和PDGF存在下，DMSO/BHA可诱

13、导大鼠骨髓基质细胞向神经细胞分化。间充质干细胞分化向内皮细胞分化w血管内皮生长因子血管内皮生长因子(VEGF)(VEGF)多能成体祖细胞(multipotentadult progenitor cells,MAPCs)是骨髓MSCs 的一个亚群。2002 年,首次在体外用血管内皮生长因子(VEGF)把人骨髓MSCs 诱导分化成具有脉管母细胞表型的细胞,随后这些细胞分化成表达内皮细胞标记物的细胞。在培养过程中MAPCs可以不断扩增80多个群体,倍增时间没有明显衰退表现,所以在临床治疗方面,MAPCs是一种理想的内皮细胞来源。w牛垂体内皮细胞生长添加剂牛垂体内皮细胞生长添加剂(endothelia

14、l cell growth supplement from bovine pituitary,ECGS)国内学者用牛垂体内皮细胞生长添加剂(endothelial cell growth supplement from bovine pituitary,ECGS)对兔MSCs进行定向诱导分化，细胞80%融合时呈现“铺路石”样形态,细胞免疫组化证实扩增细胞表达CD31和von Willebrand factor(vWF),具有吞噬ac-LDL的功能,且扩增细胞在体外参与网状血管样结构形成。因此认为,在体外能诱导MSCs向内皮细胞分化。w此外，在创面微环境下在创面微环境下,MSCs可分化为血管内皮

15、细胞,并参与创面修复。间充质干细胞分化向肝细胞分化w 用肝细胞生长因子肝细胞生长因子(HGF)(HGF)和成纤维细胞生长因子和成纤维细胞生长因子-4-4(FGF-4)在体外已成功地将多能成体祖细胞能成体祖细胞（MAPCs）诱导分化成具有形态、表型和功能特征的肝细胞。w 把大鼠、小鼠和人的MAPCs 接种到铺有基质明胶或纤维连结素基质明胶或纤维连结素的培养瓶中,用60%DMEM(60%DMEM(低糖型低糖型)+10%FCS)+10%FCS 培养体系培养,并加入HGFHGF和和/或或FGF-4FGF-4。在培养的第7天,MAPCs分化成表达肝细胞核因子-3(HNF-3)、GATA4、CK19和-甲

16、胎蛋白的上皮样细胞,在1428天,这些上皮样细胞表达CK18、HNF24 和HNF-1a。大约在21天,CK18和白蛋白染色阳性。间充质干细胞分化向胰岛细胞分化w 先用bFGF,EGFbFGF,EGF等因子诱导成人MSCs向nestin阳性的祖细胞(NIP)分化；w 再用高糖无血清培养基和细胞调节素、尼克酰胺等诱导NIP向胰岛样细胞分化 w 结果表明MSC经第一阶段的诱导后可分化成NIP,继续诱导6天后变圆的细胞逐渐增多，并聚集成团，双硫腙染色阳性，免疫组化实验证明经两阶段诱导后的细胞表达胰岛素、胰高血糖素、生长抑素等内分泌激素，放免分析结果表明，诱导的胰岛样的细胞团可分泌胰岛素，糖反应性较弱骨髓间充质干细胞的诱导分化w 体外诱导分化分化形成细胞类型化学物质或细胞因子脂肪细胞 成骨细胞 软骨细胞肌肉细胞神经细胞心肌细胞胰岛细胞肝细胞内皮细胞异丁基-甲基黄嘌呤（isobutylmethylxanthine,IBMX）+地塞米松（dexamethasone,Dex）+吲哚美辛（indomethacin,IM）+胰岛素（insulin）5 氮胞苷(24h)+地塞米松+胰岛素地塞米松+胰岛素地