蛋白类药物强制降解研究进展.docx

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1、蛋白类药物强制降解研究进展张晓腾，韩建军，白燕华北制药金坦生物技术股份有限公司，石家庄050035蛋白类药物在肿瘤、免疫等疾病上，具有特异性高、疗效快、安全性好等优点，因此，近年来，蛋白类药物的研发引起了人们广泛的关注，尤其是抗体药物，已成为医药领域发展最迅速、研发数量最多的产品之一Ll-21o截至2022年，单克隆抗体产品全球销售额约1250亿美元，占药品总销售额的15%312022年共批准上市了9款抗体药物，累计上市的抗体药物数量是2022年的近3倍，且后期临床管线较丰富，与2022年相比，处于后期研究阶段的抗体疗法数量增加了2倍多；同时，早期临床管线也较多，据统计，有500多种新型抗体疗

2、法已进入临床I、1/11、11期试验4-5。蛋白类药物主要成分是蛋白质，其分子量大、不稳定且具有高度复杂的二维和三维构象，有些蛋白质还有特定的糖基化修饰，其不稳定性导致对外界条件较敏感，易发生降解，从而影响其功效。蛋白类药物的降解产物具有免疫原性，这也是蛋白类药物的主要危险因素。因此,稳定性研究是蛋白类药物质量控制的重要内容之一。美国食品药品监督管理局(FoodandDrugAdministration,FDA)国际人用药品注册技术协调会(TheInternationalCouncilforHarmonisationofTechnicalRequirementsforPharmaceutica

3、lsforHumanUse,ICH)(QIA8、ICHQ5C)和世卫组织(WorldHealthOrganization,WHO)(Annex10)指南规定了药物稳定性试验的要求，用于了解在各种环境因素的影响下，原料药和药品的质量是如何随时间变化的。强制降解是稳定性试验中最重要的部分，也是预测药物稳定性最常用的工具,可以预测外界条件对药品纯度、效力和安全性的影响，从而制定药品包装、运输、储存等条件要求。目前，对于强制降解研究，仅在ICHQlB中对强光条件设置有明确的规定，其他条件如高温、高湿、酸/碱水解及氧化条件均无明确规定。虽然化学药物强制降解研究已相对成熟，但蛋白类药物对环境和条件更敏感，

4、因此，蛋白类药物强制降解与化学药物差异较大。本文主要综述了蛋白类药物的强制降解条件及其对蛋白质结构的影响，以期为蛋白类药物强制降解试验条件设计提供理论参考依据。1蛋白类药物不稳定性因素蛋白类药物的稳定性由物理稳定性和化学稳定性组成。物理不稳定性与蛋白质高阶结构的变化有关，包括热不稳定性和构象不稳定性，其中热不稳定性与蛋白质的展开温度有关；构象不稳定性与蛋白质的三维结构有关。物理不稳定性可能由降解导致，如去折叠、解离、变性、吸附、聚集和沉淀，其中蛋白质去折叠是非常重要的物理不稳定性因素，会影响蛋白质的二级结构和三级结构，这种构象变化可能会导致蛋白类药物的生物活性下降并可诱导不可逆的蛋白质聚集L6

5、-81而化学不稳定性与蛋白类药物一级结构中共价键的形成和/或断裂有关,可由氧化、还原、脱酰胺、水解、精氨酸转化、B-消除等不同降解途径引发9o2蛋白类药物强制降解条件不同类型的蛋白质其结构、分子量均不相同，导致稳定性差异较大，因此，难以制定强制降解条件的统一标准。但目前对于降解量，FDA和WHo建议为5%30%强制降解的条件若过于激烈，可能会导致次级降解产物的生成，甚至导致主峰被完全破坏，且在研究中这些次级降解产物的稳定性较差，对于蛋白类药物的稳定性及杂质谱无指导价值。若强制降解的条件过于平缓，降解产物的含量很难达到检出限或者定量限，进而很难对稳定性试验中可能出现的杂质做出正确的预测。因此，合

6、理的试验条件是强制降解成功的关键。目前，强制降解试验条件主要考察高温、PH（强酸、强碱）、氧化、光照、反复冻融、振荡等。2. 1高温蛋白类药物受温度影响较大，一般储存于28。C下，随着温度的升高，蛋白构象可能会发生展开或者部分展开，展开后的蛋白质更易发生降解或者聚集。随着温度的持续升高，会达到蛋白质融化温度，导致蛋白质发生不可逆的聚集。在高温下，构象发生变化的蛋白质其氨基酸更易与化学物质发生反应，因此，在高温下，蛋白质除了发生聚集外，还会伴随其他化学反应，如氧化、脱酰胺等。蛋白类药物的温度设置条件需高于稳定性研究加速考察温度的10以上，还需低于融化温度的10-20,才可以获取有效的降解信息Mc

7、avan等10研究表明，IgG4单克隆抗体在40、50。C处理14d后，发生了聚集反应，进一步对肽图进行分析发现，Met、Trp和HiS残基发生了氧化，且50。C处理下，发生了明显的脱酰胺反应；同时，利妥昔单抗在45、55、65oC处理4h,发现在低于熔化温度（45、55）时，His和Lys残基发生变化，进而导致单抗的拓扑结构发生了变化，而在65C时，利妥昔单抗发生聚体沉淀。药物的高温降解一般遵循阿伦尼乌斯（Arrhenius）方程，其可用来实时预测蛋白质降解情况，但蛋白类药物降解并不遵循阿伦尼乌斯方程。Didier等Lll发现冻干减毒活疫苗在37。C强制条件下处理14d,病毒的滴度下降不符合

8、阿伦尼乌斯方程，分析原因为病毒滴度下降首先由病毒与海藻糖之间的氢键发生变化引起，而后发生构象变化螺旋增加、B-转角减少）和脱酰胺导致病毒失活造成病毒滴度下降，该现象实际遵循二级动力学方程。在其他生物制品中，高温对蛋白类药物造成的降解也发现此种情况，二级动力学模型在储运期间（包括温度偏移）的稳定性均可以被准确预测，而阿伦尼乌斯方程在稳定性预测方面会产生显著误差12。2.2 PH蛋白质在极端PH条件下由于维持构象的分子内或分子间作用力（如氢键、静电力和疏水力）被破坏，从而可能导致永久变性或聚集。在细胞培养阶段、低PH病毒失活、纯化阶段等常造成局部溶液PH极端，进而导致蛋白类药物降解，因此，对于工艺

9、研究，了解极端Pll条件导致的蛋白类药物降解至关重要。蛋白类药物PH强制条件一般为低PH在35之间，高PH在89之间，处理时间13周，甚至3个月13。低PH条件下蛋白类药物易发生GIn脱酰胺和ASn残基脱酰胺，在高PH条件下蛋白类药物易发生Met残基氧化、Gln残基脱酰胺、Asn残基脱酰胺和蛋白质纤维化14。但以上条件并不是绝对的，药品中的某些物质也会导致蛋白类药物的降解，如在低PH下，中国仓鼠卵巢细胞宿主蛋白也会加速蛋白类药物Phe和TrP残基的降解15o高温可以加速PH依赖的降解，因此，PH诱导的强制降解试验的温度一般在25OC或者4016。但温度对PH诱导的强制降解加速并不是绝对的，与缓

10、冲液类型也有一定的关系。PaCea等17发现温度影响不同PH缓冲液下IgGl单克隆抗体的脱酰胺速率，在40P时，酸性缓冲液溶液的脱酰胺速率快于碱性缓冲液，但在5。C时，碱性缓冲液溶液的脱酰胺速率快于酸性缓冲液，原因为OH-浓度与单克隆抗体的脱酰胺速率相关，而温度的剧烈变化会影响缓冲液中的0H-浓度。PH对温度造成的蛋白质聚集影响较大，人单克隆IgG2抗体在4OC下表现出典型的PH依赖性的二聚体聚集。然而在37OC下，高分子量聚集体与PH呈负相关关系，表明其与温度介导的剪切相关口8。2.3 氧化蛋白类药物中S原子比较活跃，容易被氧化，因此，Met和CyS残基是最容易被氧化的氨基酸。在碱性条件下，

11、Met和Cys残基氧化可生成Met亚飒或Met飒甚至形成分子内/间二硫键。由于氨基酸结构中存在芳香环，芳香环容易被氧化，因此，His、Tyr和IYP残基也容易被氧化19。蛋白质的氧化易受到外界环境的刺激，进而加速氧化，如某些金属离子、高温、光照、化学添加剂等。最常用的化学氧化剂为H202、叔丁基过氧化氢、2-偶氮双（2-氨基丙烷）二盐酸盐等，常用的金属离子为Fe2+、Fe3+、Cu2+、Mn2+等，其中H202氧化法是最经典的氧化方法，添加量为0.03500mmolLT,但反应时间差异较大。氧化法常结合高温或者光照辅助加速氧化，但有时氧化反应速度过快，并且在低温甚至冷冻条件下仍然可以进行，因此

12、，很难将氧化反应终止，目前，最常用的氧化终止法是缓冲液交换法。蛋白类氧化会造成药物的疗效降低，甚至导致蛋白质空间结构发生变化。Singh等20在25条件下采用300mmolH202氧化人粒细胞刺激因子（humangranulocyte-stimulatingfactor,G-CSF）,发现GYSF的Met残基最易被氧化，氧化位点为Met1、Metl38Metl27和MetI22,其中MetI27和MetI22的氧化还会引起GYSF的Aspll3和Thrll7残基的轻微位移，从而导致局部构象发生变化。此外，一些赋形剂（如聚山梨酯、聚乙二醇和吐温-80）、润滑剂和包装材料的过氧化物的污染可导致蛋白

13、类药物的氧化21。使用不同的氧化剂虽然均能氧化蛋白质，但氧化的位点优先顺序却存在差异，强光氧化条件下IgGl重链的Met优先氧化，而叔丁基过氧化氢氧化条件下Met氧化是随机的22。2.4 光照蛋白类药物一般建议避免阳光直射，并且有些药物需采取相应的措施以避免直接或者长期暴露于阳光下，但在蛋白类生产用药过程中很难完全避免光照，如纯化层析过程中紫外灯的检测、半成品的配制和转移可能暴露于人工光源下等。光强制降解是众多条件中，唯一有指导原则的试验。ICHQlB光稳定性试验指导原则要求对光源的波长分布除45065Onm的可见光区外，还应包括32040Onm的近紫外区。因此，光源有2种选择方式，第1种是光

14、源分布波长特性相当于ISO室外日光标准D65与室内间接日光标准ID65的光源，如日光荧光灯、氨灯、卤灯等；第2种是同时暴露于冷白荧光灯和近紫外荧光灯下。并且ICH还要求样品应暴露于总照度不低于1.2X1061xh,近紫外能量不低于200whm-2o光诱导的强制降解与蛋白质的结构和构象、制剂配方组成、包装形式以及光波长、光强度和光照时间密切相关。光强制降解可导致多种产物生成，包括蛋白质聚集、交联和降解。光强制降解常作用于Cys、TYp、Tyr和Phe靶点23。光照条件下存在的氧化剂或者金属离子均可加速蛋白质氧化。光强制降解虽然只影响单个氨基酸的化学变化，但单个氨基酸可能在活性氧和水共同存在下与其

15、他氨基酸发生反应使蛋白质的构象发生变化，从而导致聚集,或者在长期储存期间，产生的小浓度聚集物作为成核中心，进而产生可见颗粒物。酪氨酸的氧化产物是二酪氨酸，脱质子化的二酪氨酸具有光敏作用，可以产生02-、H202和02,进一步与其他氨基酸发生反应，破坏蛋白质的空间结构24。除了蛋白类药物的氨基酸光照后形成的氨基酸氧化产物是光敏剂外，糖基化终产物和过氧化物也可以作为光敏剂，进而破坏蛋白质的结构。蛋白质可与还原糖发生非酶反应，形成结构多样的杂环交联产物一一高级糖基化终产物，如戊糖甘、甲基乙二醛赖氨酸二聚体、乙二醛赖氨酸二聚体和脱氧葡萄糖基赖氨酸二聚体。这种高级糖基化产物在紫外光的作用下产生02二H2

16、02和02等，进而氧化破坏蛋白质的结构1.25-26L蛋白类药物制剂中一般不存在还原糖，但蔗糖等二糖常作为稳定剂添加到制剂中。蔗糖在酸性和高温条件下易水解为葡萄糖和果糖，如单克隆抗体在蔗糖中29。C保存6个月即可以生成高级糖基化产物25。聚山梨酯-80是蛋白类药物中常用的抗氧化剂，亚油酸是其游离的脂肪酸成分。亚油酸可以通过残余宿主细胞蛋白的催化水解或者氧化释放出来。亚油酸可以进一步氧化生成丙二醛。丙二醛可与Lys残基反应生成二氢此脸加合物，其在光照条件下可产生02,以氧化蛋白质27。2.5 反复冻融蛋白类药物在储藏和运输过程中，易受到外界环境的剧烈变化导致发生冻融过程。蛋白类药物运输储藏过程中易发生低于0情况，此时药物是否可以使用需要依据蛋白类药物反复冻融的机制去评估。在反复冻融过程中，可能会发生蛋白质与冰表面张力变化、温度剧烈变化、浓缩、赋形剂结晶、相分离和PH变化，