抗炎作用实验研究思路与方法.ppt

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1、第五讲第五讲 抗炎作用实验研抗炎作用实验研究思路与方法究思路与方法 炎症反应炎症反应是临床常见病理生理过程，感染、是临床常见病理生理过程，感染、缺血、抗原缺血、抗原-抗体反应、化学、热或机械损抗体反应、化学、热或机械损伤等均可诱发炎症反应。伤等均可诱发炎症反应。中药中具有明确抗炎作用的药物类别有：中药中具有明确抗炎作用的药物类别有：解表药，清热药，祛风湿药，泻下药，温里药，解表药，清热药，祛风湿药，泻下药，温里药，活血化瘀药，化痰止咳平喘药，开窍药等活血化瘀药，化痰止咳平喘药，开窍药等实验动物的选择实验动物的选择 哺乳动物，雄性。哺乳动物，雄性。足趾肿胀法用大鼠。足趾肿胀法用大鼠。过敏性炎症首

2、选豚鼠。过敏性炎症首选豚鼠。常用抗炎实验方法常用抗炎实验方法 根据致炎性质的不同分为两大类：根据致炎性质的不同分为两大类：（一）非特异性炎症模型：（一）非特异性炎症模型：致炎因子主要有：异性蛋白（如鸡蛋清）、颗粒致炎因子主要有：异性蛋白（如鸡蛋清）、颗粒性异物（如性异物（如角叉菜胶角叉菜胶*、棉球、酵母）、化学物质、棉球、酵母）、化学物质（二甲苯、松节油、甲醛）（二甲苯、松节油、甲醛）（二）免疫性炎症模型：（二）免疫性炎症模型：细胞介导的超敏反应性炎症，免疫复合物介导的细胞介导的超敏反应性炎症，免疫复合物介导的炎症反应模型。炎症反应模型。（一）非特异性炎症模型（一）非特异性炎症模型 非特异性炎

3、症反应有三期：非特异性炎症反应有三期：早期（急性）早期（急性）炎症时相，以局部血管扩张和毛细炎症时相，以局部血管扩张和毛细血管通透性增加为特征；血管通透性增加为特征；中期（亚急性）中期（亚急性）时相，以血小板粘附、白细胞和时相，以血小板粘附、白细胞和吞噬细胞的浸润为特征；吞噬细胞的浸润为特征；炎症晚期（慢性增殖期）炎症晚期（慢性增殖期）以纤维组织增生、纤维以纤维组织增生、纤维化和肉芽屏障形成为特征。化和肉芽屏障形成为特征。急性和亚急性炎症的实验方法：急性和亚急性炎症的实验方法：1、毛细血管通透性测定：、毛细血管通透性测定：评价药物对炎症物质引起的血管通透性增加的抑制评价药物对炎症物质引起的血管

4、通透性增加的抑制作用。作用。【原理】常用染料渗出法，如伊文思蓝与血浆蛋白稳【原理】常用染料渗出法，如伊文思蓝与血浆蛋白稳固结合，当致炎因子固结合，当致炎因子（醋酸，组织胺，（醋酸，组织胺，5-5-羟色胺，羟色胺，PGPG等）等）诱导毛细血管通透性升高时，在一定范围内染料的诱导毛细血管通透性升高时，在一定范围内染料的漏出量可反应渗出毛细血管的血浆蛋白量。漏出量可反应渗出毛细血管的血浆蛋白量。【方法一】【方法一】取取雄性雄性大鼠或小鼠，随机分组，给予受试药物、大鼠或小鼠，随机分组，给予受试药物、阳性药物或生理盐水。阳性药物或生理盐水。30min30min后，在已剃毛的背部两个部位分别皮内注射后，在

5、已剃毛的背部两个部位分别皮内注射组胺和组胺和5-5-羟色胺，立即静脉注射羟色胺，立即静脉注射1%1%伊文思蓝溶液。伊文思蓝溶液。15min15min后，处死动物，剥离背部皮肤，测量注射部后，处死动物，剥离背部皮肤，测量注射部位着色面积，或者剪下着色皮肤，切碎，在水位着色面积，或者剪下着色皮肤，切碎，在水-丙丙酮溶液中浸泡酮溶液中浸泡24-48h24-48h，过滤，分光光度计比色。，过滤，分光光度计比色。 评价评价 本法操作简单，但操作时应注意：伊文斯兰注入量本法操作简单，但操作时应注意：伊文斯兰注入量一定要准确，滴二甲苯浸润皮肤要仔细。一定要准确，滴二甲苯浸润皮肤要仔细。皮肤毛细血管通透性增高

6、是抗炎作用研究的最常用皮肤毛细血管通透性增高是抗炎作用研究的最常用的模型之一。操作简单，重现性较好。实验结果的模型之一。操作简单，重现性较好。实验结果直观。直观。【方法二】【方法二】取小鼠随机分组，给药取小鼠随机分组，给药1-21-2小时后，各鼠静脉注射小时后，各鼠静脉注射0.5%0.5%伊文斯兰生理盐水溶液伊文斯兰生理盐水溶液0.1 ml/10g0.1 ml/10g，随即腹，随即腹腔注射腔注射0.6%HAC 0.2ml/0.6%HAC 0.2ml/只，只，20min20min后处死动物，后处死动物，打开腹腔，用生理盐水分次冲洗腹腔，合并洗涤打开腹腔，用生理盐水分次冲洗腹腔，合并洗涤液离心，取

7、上清液液离心，取上清液590nm590nm处比色测定，计算腹腔染处比色测定，计算腹腔染料量，评价毛细血管通透性。料量，评价毛细血管通透性。2、炎性肿胀的测定、炎性肿胀的测定（1）小鼠耳廓肿胀法：耳廓涂抹致炎剂）小鼠耳廓肿胀法：耳廓涂抹致炎剂 致炎剂：致炎剂：二甲苯，巴豆油合剂。二甲苯，巴豆油合剂。（2）大鼠足趾肿胀法：足趾皮下注射致炎剂）大鼠足趾肿胀法：足趾皮下注射致炎剂 致炎剂：致炎剂：鸡蛋清，角叉菜胶，酵母，甲醛，右旋糖鸡蛋清，角叉菜胶，酵母，甲醛，右旋糖酐，酵母液，组胺，酐，酵母液，组胺，5-5-羟色胺，制霉菌素羟色胺，制霉菌素 检测指标检测指标 大鼠足趾肿胀法，测定大鼠足趾或关节的周长

8、、大鼠足趾肿胀法，测定大鼠足趾或关节的周长、厚度或整个足趾、踝关节的容积。厚度或整个足趾、踝关节的容积。小鼠耳廓肿胀法，测定小鼠耳廓重量或者厚度。小鼠耳廓肿胀法，测定小鼠耳廓重量或者厚度。【评价】【评价】脚肿胀模型是最常用的抗炎实验模型，多种化学、脚肿胀模型是最常用的抗炎实验模型，多种化学、物理以及免疫学刺激均可导致大鼠脚爪水肿，因物理以及免疫学刺激均可导致大鼠脚爪水肿，因水肿发展和消退的快慢及持续时间不同，可将其水肿发展和消退的快慢及持续时间不同，可将其分为急性、亚急性和慢性脚肿胀，急性脚肿胀一分为急性、亚急性和慢性脚肿胀，急性脚肿胀一般于给与致炎剂数十分钟或般于给与致炎剂数十分钟或1-3小

9、时炎症迅速发展小时炎症迅速发展至高峰，数小时内会消退。至高峰，数小时内会消退。慢性脚肿胀于数至十日以上发展逐渐达高峰，亚急慢性脚肿胀于数至十日以上发展逐渐达高峰，亚急性介于中间。性介于中间。 化学物质刺激所致急性脚肿胀最常用，如化学物质刺激所致急性脚肿胀最常用，如组织胺、组织胺、5-5-羟色胺、缓激肽、羟色胺、缓激肽、PGsPGs、角叉菜、角叉菜胶、右旋糖酐、新鲜鸡蛋清、甲醛、酵母、胶、右旋糖酐、新鲜鸡蛋清、甲醛、酵母、琼脂等。琼脂等。芥子末、制霉菌素可以制备亚急性肿胀。芥子末、制霉菌素可以制备亚急性肿胀。炎症慢性增殖期模型炎症慢性增殖期模型 肉芽肿模型：肉芽肿模型：应用巴豆油、脱脂棉、海绵、

10、玻璃棒、塑应用巴豆油、脱脂棉、海绵、玻璃棒、塑料环、纸片等埋入动物局部皮下，可引起料环、纸片等埋入动物局部皮下，可引起与临床某些炎症后期病理变化相似的肉芽与临床某些炎症后期病理变化相似的肉芽增生，然后观察药物对肉芽重量的影响。增生，然后观察药物对肉芽重量的影响。常用方法：塑料环法；大鼠巴豆油气囊法；常用方法：塑料环法；大鼠巴豆油气囊法；棉球植入法；琼脂皮下注射法等。棉球植入法；琼脂皮下注射法等。（二）免疫性炎症模型（二）免疫性炎症模型 细胞免疫、免疫复合物所介导的炎症反应在各种风细胞免疫、免疫复合物所介导的炎症反应在各种风湿性疾病，尤其是类风湿性关节炎病理过程中起着湿性疾病，尤其是类风湿性关节

11、炎病理过程中起着主导作用，因此这类免疫性炎症模型对研究抗炎抗主导作用，因此这类免疫性炎症模型对研究抗炎抗风湿药物有重要价值。细胞介导的超敏反应性炎症风湿药物有重要价值。细胞介导的超敏反应性炎症系由抗原进入机体使系由抗原进入机体使T细胞致敏，当再次接触抗原，细胞致敏，当再次接触抗原，致敏致敏T细胞分化增殖，释放各种淋巴因子以及直接杀细胞分化增殖，释放各种淋巴因子以及直接杀伤靶细胞，引起单核细胞浸润为主的局部炎症反应。伤靶细胞，引起单核细胞浸润为主的局部炎症反应。免疫复合物所介导的炎症反应，系由抗原抗体形成免疫复合物所介导的炎症反应，系由抗原抗体形成复合物，激活补体，导致白细胞趋化激活，释放一复合

12、物，激活补体，导致白细胞趋化激活，释放一系列致炎因子产生局部和全身炎症反应。系列致炎因子产生局部和全身炎症反应。1 1、大鼠佐剂性关节炎、大鼠佐剂性关节炎 常作为类风湿性关节炎的一种实验模型。常作为类风湿性关节炎的一种实验模型。将弗氏完全佐剂皮内注入大鼠足趾部或尾根部致炎。将弗氏完全佐剂皮内注入大鼠足趾部或尾根部致炎。原发病变类似于一般炎性水肿，在致炎部位原发病变类似于一般炎性水肿，在致炎部位12h12h后出现后出现肿胀。继发病变由迟发性超敏反应引起，在致炎肿胀。继发病变由迟发性超敏反应引起，在致炎10d10d左左右右后出现对侧、前肢足爪肿胀，耳、尾、出现炎症结后出现对侧、前肢足爪肿胀，耳、尾

13、、出现炎症结节和红斑等。节和红斑等。【评价】【评价】本方法特异性高，假阳性率低，结果可靠。属于本方法特异性高，假阳性率低，结果可靠。属于免疫性关节炎模型。该模型比其他模型更接近于免疫性关节炎模型。该模型比其他模型更接近于临床类风湿性关节炎（临床类风湿性关节炎（RARA）。）。弗氏完全佐剂的制备是模型成败的关键。（液体弗氏完全佐剂的制备是模型成败的关键。（液体石蜡：羊毛脂（石蜡：羊毛脂（2:12:1）共热至）共热至7070，混匀，加入灭，混匀，加入灭菌的卡介苗按照每毫升中加菌的卡介苗按照每毫升中加2-10mg2-10mg制备。制备。动物选择大鼠，雄性，动物选择大鼠，雄性，150-200g150-

14、200g之间，过小或老之间，过小或老均不敏感。均不敏感。2 2、胶原诱导的关节炎、胶原诱导的关节炎 II型胶原是软骨主要成分，具有抗原性，诱发针型胶原是软骨主要成分，具有抗原性，诱发针对关节滑膜的自身免疫反应。对关节滑膜的自身免疫反应。将将II型胶原加入弗氏佐剂中，皮内注射如大鼠足型胶原加入弗氏佐剂中，皮内注射如大鼠足趾或尾根部致炎。趾或尾根部致炎。这两种炎症模型均发生急性局部炎症期（这两种炎症模型均发生急性局部炎症期（1-41-4天）、急性炎症缓解期（天）、急性炎症缓解期（7-127-12天）、多发性关节天）、多发性关节炎为特征的慢性周身炎症期（炎为特征的慢性周身炎症期（10-2810-28

15、天）以及永久天）以及永久性关节畸形（第性关节畸形（第3535天以后）天以后）【评价】【评价】该模型比佐剂性关节炎模型更进一步，更贴近于人该模型比佐剂性关节炎模型更进一步，更贴近于人的的RARA，有体液免疫和细胞免疫协同作用，其病理，有体液免疫和细胞免疫协同作用，其病理表现为进行性滑膜炎及滑膜增生，炎性细胞浸润，表现为进行性滑膜炎及滑膜增生，炎性细胞浸润，软骨破坏，最终导致关节损伤和僵硬。在临床、软骨破坏，最终导致关节损伤和僵硬。在临床、组织学和免疫学改变上均与人的组织学和免疫学改变上均与人的RARA相似。相似。抗炎作用机制的研究方法抗炎作用机制的研究方法1、对炎症细胞功能的影响、对炎症细胞功能

16、的影响（1）多形核白细胞趋化性测定）多形核白细胞趋化性测定【原理】【原理】白细胞聚集是机体防御机制的一个重要方白细胞聚集是机体防御机制的一个重要方面。趋化因子能吸收白细胞致感染或炎症部位。面。趋化因子能吸收白细胞致感染或炎症部位。测定白细胞趋化性的方法有琼脂糖法。测定白细胞趋化性的方法有琼脂糖法。（2）巨噬细胞吞噬功能测定）巨噬细胞吞噬功能测定【机理】【机理】吞噬作用是吞噬细胞接触吞噬作用是吞噬细胞接触-胞饮胞饮-降解异物降解异物的过程。微生物、免疫复合物或其他异物必须先的过程。微生物、免疫复合物或其他异物必须先与吞噬细胞结合，才能启动这一作用。与吞噬细胞结合，才能启动这一作用。2、抗炎与垂体、抗炎与垂体-肾上腺皮质系统的关系肾上腺皮质系统的关系（1）切除双侧肾上腺大鼠或小鼠的抗炎实验）切除双侧肾上腺大鼠或小鼠的抗炎实验【原理】【原理】摘除两侧肾上腺即除去了内分泌系统（下丘脑-垂体-肾上腺轴）的影响，再进行抗炎实验，以观察药物抗炎作用是否与垂体-肾上腺系统有关。（2）血浆皮质醇含量的测定）血浆皮质醇含量的测定作为一个指标，结合抗炎实验进行。3、花生四烯酸代谢测定、花生四烯酸代谢测定【原