0003细胞总蛋白提取及讨论.docx

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1、细胞总蛋白提取细胞处理后，弃去培育液；用4预冷PBS洗1遍，吸水纸吸取残留的PBS；加入冰上预冷的蛋白裂解液100Ul【配方:RIPA裂解液Iml+PMSF工作液（IOnIM）IOul+正矶酸钠（2mM）IOul,使之匀称平铺于细胞面，反复吹打，冰上静置30min;用细胞刮刀将细胞刮于培育皿一侧（显微镜下视察确认），收集至预冷1.5mlEP管中，超声裂开细胞Ilnin,静置5min,使细胞充分裂解；4,12000r离心15min;取上清液至另一1.5mlEP管，置于冰上分装2u1用于BCA法测定蛋白质浓度，其余处理后保存备用或干脆上样。细胞总蛋白的提取及裂解液一.悬浮细胞计数107重悬于0.5

2、mlPBS。OIM）中，加入饱和浓度一抗（1/10）或（IoUg/ml）4C15-30min后,短暂离心4000转3分，用重悬（室温）,加入饱和浓度二抗（1/100）或（20ugml）,快速置于37C水浴中2-5分后（快速加入终止液0.5ml（冷pbs中含有400uMNa3VO4,5mMEDTAzIOmMNaF）,离心4000转x3分，弃上清,置于冰浴中,加入裂解液0.2-03ml（裂解浓度108/ml?）吸管轻轻混匀，冰点缓慢震摇孵育30分钟后加入Ic）Ul浓度为Iomg/ml的PMSF储存液，冰点孵育30分钟。4度离心15000g20mi上清液即为全部细胞溶解成分。二.裂解缓冲液：50mM

3、Tris-HCIpH7.6或20mMHepespH7.4150-300mMNaCIl（ww）NP-40（0.5%Triton-X100）5mMEDTA（现力口Iml力口IOuD临用前加入蛋白酶抑制剂：Na3VO4机酸钠ImM（75mM-13.3ulml）（用0.2mol/1.储存液配制）PMSF苯甲酰氟ImM（10mgmlPMSF用量：10ulml）或10-20ugmlSoybeanTrypsininhibitor（力口10-20ul）Aprotinin抑肽酶10ugml（10ulml）（1.eupeptin亮肽素10ugml未力口）Westernblotting三.给你介绍一个裂解液：50m

4、MTris-HCI（PH8.0）缓冲液，含：NaCIISOmM叠氮钠0.02%SDS0.1%NP-401%PMSF100ugml（运用前临时加入）（10mgmlPMSF用量:10ulml）尽量用少的裂解液裂解细胞，取上清电泳，最好用6xSDS上样buffer。四.我的样品蛋白是这样制备的：1 .将与腺病毒转染液共培育24小时的细胞消化下来2 .离心收集细胞3 .向离心管里加入40微升IXPBS缓冲液，随后再加入40微升21.amilybuffer（由tris碱和SDS组成）裂解细胞4 .将细胞裂解液放入沸水中加热五分钟，放冷后离心.5 .测定蛋白浓度，加样电泳我所说的前沿有蛋白是指胶的底端，不

5、是指加样孔下面有蛋白.胶的浓度应当没问题。五.碧云天公司技术支持Western及IP细胞裂解液的主要成分为20mMTris（pH7.5）,150mMNaCI,1%TritonX-100,以及焦磷酸钠，%glycerophosphate,EDlA,Na3VO4,Ieupeptin等多种抑制剂。可以有效抑制蛋白的降解，并维持原有的蛋白间相互作用。（-20C保存，一年有效。）假如是贴壁细胞，根据6孔板每孔加入100微升裂解液的比例（即细胞培育液量的1/20）加入裂解液。六.军科院技术支持裂解液（50mmol1.TrisTHCIpH8.0,150mmol1.NaCI,1%TritonX-100,100

6、ugmlPMSF）：lmol1.TrisPHCI（pH8.0）2.5mlNaCI0.438gTritonX-1000.5ml蒸储水至50ml混匀后，4保存。运用时，加入PMSF至终浓度为100Ug/ml（0.87ml裂解液力口入1.74mgmlPMSF50l）o七.操作方法：蛋白样品制备：（1）单层贴壁细胞总蛋白的提取：1、倒掉培育液，并将瓶倒扣在吸水纸上使吸水纸吸干培育液（或将瓶直立放置一会儿使残余培育液流到瓶底然后再用移液器将其吸走）。2、每瓶细胞加3ml4度预冷的PBS（0.01MPH7.27.3）。平放轻轻摇动Imin洗涤细胞，然后弃去洗液。重复以上操作两次，共洗细胞三次以洗去培育液。

7、将PBS弃净后把培育瓶置于冰上。3、按Iml裂解液加IoIlIPMSF（100mM）,摇匀置于冰上。（PMSF要摇匀至无结晶时才可与裂解液混合。）4、每瓶细胞加400Ul含PMSF的裂解液，于冰上裂解30min,为使细胞充分裂解培育瓶要常常来回摇动。5、裂解完后，用干净的刮棒将细胞刮于培育瓶的一侧（动作要快），然后用枪将细胞碎片和裂解液移至1.5ml离心管中。（整个操作尽量在冰上进行。）6、于4度下1200OrPm离心5min0（提前开离心机预冷）7、将离心后的上清分装转移倒0.5min的离心管中放于一20度保存。探讨版我以前做蛋白大量表达超声裂开时，总体积为200ml,功率300瓦，超3秒，

8、停3秒，60次为一个循环，每个循环之间停5min,共作了3个循环，效果很好。不知你的“原来的80倍”是多少，假如和我的差不多，是要延长总时间，但要留意样品要放在冰上，中间停一会，防止产生的热量太多，使蛋白变性。我的方案是:1细胞先用无菌PBS洗二次；2吹下细胞后，4度12000rpmmin离心IOmin,再用无菌PBS悬浮，重复离心一次；3常规超声波处理。留意事项：1全部处理过程肯定要在冰上进行；2超声波时，肯定不要有泡沫产生；3在冰上超声波处理。她由于上次求助无人回应，一气之下遍找资料，汇总出菌体/细胞裂解的常用方法和配方，希望能对其它求助兄弟有所帮助。菌体/细胞裂解法汇总一、反复冻融法：1

9、、将细胞在-20度以下冰冻，室温融解，反复几次，由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀，使细胞结构裂开。2、至少3次以上冻溶。3、IFCC举荐法：收集细胞悬液,4低温离心(300OrPnb5min),弃上清，加入肯定量PBS(200ul),轻轻吹打混匀，-200C冷冻30min,370C解冻，如此反复3次，可形成细胞裂解液。4、用液氮冻融三四次就可以了，细胞冻住后，取出放37度水浴，溶解后震荡，再冻二、超声波处理法1、要设定好超声时间和间隙时间，一般超声时间不超过5秒，间隙时间最好大于超声时间，这些都有利于爱护酶的活性。我的试验超声时间5秒、间隙时间10秒、工作次数20次。2、每个

10、样本超声时间5秒,每个间隔5秒,粉碎5次。3、100mI菌液离心，用8ml缓冲液悬浮，加8mg溶菌酶，冰浴30min,然后超声处理。750W40%功率。5秒超声，9秒间隔。超声至少90min.4、综合冻融和超声的方法：150Og离心，弃除上清。冰上，用小体积PBS重悬细胞。将重悬液集中，1500g离心浓缩，弃除上清。液氮骤冷。用约5倍体积的PBS缓冲液重悬细胞，并搅拌。可选择：4下超声裂开细胞，加入终浓度为0.25M的KCI,15mM的DTT。4下111500gX60min离心裂解液。取出上清。过柱子。PurificationofGST-FusionProteinsfromE.col!-Alt

11、ernateProtocol三、渗透法：冰冷的20mmol/1.TriS-Cl(pH8.0),2.5mmol/1.EDTA处理，冰浴放置IonIir1。精编分子生物学试验指南四、裂解液处理法：1、细胞裂解液：50mmo1/1.Tris-ClPH6.8,100mmol/1.DTT,2%SDS,0.1%溪酚蓝，10%甘油。SDS是阴离子型表面活性剂、极易促溶、强变性作用。2、在Ioadingbuffer加SDS,100度5分钟,是变性方法。SDS与蛋白等量结合，可以通过条带位移推断蛋白大小，考染不会影响结果。:dxybbspostView?bid=65&id=4936753&sty=3&keywo

12、rds=SDS+%Cl%Dl%BD%E23、假如是做小量菌液，跑PAGE胶看其表达状况的话，可以干脆加蛋白loadingbuffer煮沸5分钟即可，需留意的是上样前要离心12000rpm至少5分钟，然后上样时，枪头别吸最底下的。4、20毫升细胞裂解液配方:401.0.5MEDTA(PH8.0),4ml10%SDS,1mlIMTris-cl(PH6.8),14.96ml蒸储水。5、我始终未明白楼主假如想收集全蛋白，而不考虑包涵体的话，为何要用超声呢？干脆水煮不就可以了吗？6、将IinI菌离心弃上清，留也许50ul,再加50Ul2X上样缓冲液，煮IOmin,取20UI上样，就可以了。:dxybbs

13、PoStview?bid=65&id=4591035&sty=3&age=0&tPg二l&ppg=1#45910357、检测蛋白诱导：从培育的不同时期各取出1ml,1200OgXInIin离心。将沉淀重悬于100ulIXSDS上样缓冲液(50mMTris-Cl(pH6.8),100rnMDTT,2%SDS,0.1%澳酚蓝，10%甘油)中，100加热3min,然后1200OgXlmin离心。上样15U1.6%SDS-PAGE电泳。分子克隆P8268、5-10秒离心，弃除上清，用50UI蒸馀水重悬沉淀。加入IUIPMSF,再加入50ul热的2XSDS上样缓冲液(IO(TC加热)。快速混匀后100加

14、热3-5mi11o将样品冰上放置(或-20放置)，然后再溶解，煮沸Ilnin0离心30秒。上样5ul进行SDS-PAGE电泳。2XSDS上样缓冲液：250mMTris-Cl,6.2%(wv)DTT,8%SDS,0.002%(wv)澳酚蓝，40%甘油。PurificationofGST-FusionProteinsfromE.colio9、裂解液：50mMTris-HCl(pH8.59.0),2mMEDTA,100mMNaCl,0.5%TritonX-100,lmgml溶菌酶。10、我们用NP40（NP40：NONIDETp-40乙基苯基聚乙二醇,是一种非离子表面活性剂。）加DTT和蛋白酶抑制剂

15、裂解细胞，冰上放306OnIin,然后1300OrPm离心15min,取上清定量。11、裂解液配方是：50mmol1.Tirs-HCI（PH8.0）,150mmol1.NaCI,0.02%叠氮钠,100g/mlPMSF,1g/mlAprotinin,1%TritonX100（orNP-40）012、对于组织培育中生长的细胞，最有效的裂解方法是用去污剂（表面活性剂）进行处理，溶解细胞膜并溶解蛋白质。50mmol1.Tirs-HCl（PH8.0）150mmol1.NaC10.02%叠氮钠、100g/mlPMSF1g/mlAprotinin1%TritonX100（orNP-40）,这种裂解液可能是最常用的裂解缓冲液。13、细胞裂解液的主要目的：（1）利用去污剂破坏脂质双分子层，裂开细胞；（2）溶解蛋白；（3）蛋白变性使其稳定；（4）抑制蛋白酶活性。举荐RIPAbuffer:50mMTris-HClPH7.4（缓冲体系），150mMNaCl（等渗体系），ImMPMSF（强大的蛋白酶抑制剂），1InMEDTA（变性剂和稳定剂），5gmlAprotinin（蛋白酶抑制剂），5