G418筛选细胞(整合版).docx
G418筛选细胞G418前介：G418是一种氨基糖苗类抗生素，在分子遗传忒验中，是桎定转染最常用的抗性筛选试剂。白色粉末,融点138144C,溶于水、甲醇。CASNo.：108321-42-2分子式：C20H40N401022H2S04分子量：692.71储运室温下运输，干粉在室温下储存，溶液r-20C储存.G418工作原理：它通过抑制转座子Tn601,Tn5的基因,干扰80S核触体功能而阻断蛋白质合成,对原核和真核等细胞都有毒性，包括细菌、酵母、植物和哺乳动物细胞，也包括原生动物和蠕虫。细菌Tn5转座了序列（neo抗性基因）携带的氨基糖昔磷酸转移旃可以将G418转变成无毒形式。当noo基因被整合进真核细胞基因组合适的地方后，则能启动neo基因编码的序列转录为mRNA,从而获得抗性产物氨基糖件磷酸转移曲的高效表达，使细胞获得抗性而能在含有G418的选择性培育基中生长。利用G418篇选细胞：I、打算工作在筛选之前，肯定要确定你的细胞对这一批G418的最佳筛选浓度。每种细胞对G418的敏感性不同，般变动在100ugmri000ugml范用。分子克隆蛤出的几个常用解原原所需G418的量隹用细电系或机体G418浓度（ug*i）中国仓取卵果细胞700'800Madin-Darby犬肾细胞500人上皮AI31细胞.400狼CVT细胞500盘星网柄菌属10'35植物10酵母125'5002、确定最佳篇选浓度最适用量通过建立细胞死亡曲线获得。将细胞稀秣至100oCeIl/ml,每孔100ul加入有培育基的24孔板。G418浓度稀释至0,100,200,300,400,500,600,700,800,900,1000,1100ugml等12个级别，培育10T4天，以细胞全部死亡最低浓度为基准，一般400-800左右。篇选时比该浓度再高一个级别.滩持时运用筛选浓度的一半即可。汇合度对G418筋选结果的影响很大，一般篇选时汇合度不宜超过60%I3、加药时间1.一般要在转染24小时之后才起先加G418箫选由于基因转染到细胞内之后要段时间才能表达出蛋白质。所以筛选不能太早：但是也不能太晚，因为转染了外源基因的细胞代谢负荷较大，增殖较慢，时间长了就会被没仃外源基因传入的细胞所沉没，最终导致筛选不出阳性克隆）.每3'5d更换一次含有G418的筛选液（因为随者细胞的代谢G418的浓度和活性都会下降），这时药物浓度可以降至200ugmlt,4、培育液的运用加药筛选约6天左右，细胞会大量死亡：:非选择性死亡；死亡的细胞会裂说明放出有害物班，导致那些有ne。表达的阳性细胞死亡。阳性细胞的状态不佳甚至死亡，孔中细胞数目很少，细胞之间的信号会变得很弱，导致阳性细胞死亡这个时候须要一种特别的培育液：转染前，在细胞汇合度达到80%的时候，换液,培育过夜之后收集培育液，通过港器消毒，和簇新的培育液按1：1混合备用。再转染后筛选过程中就可以应用这种培育基。5、选择单克隆的优化（箭选阳性克It）目的，尽珏削减阴性克隆的死亡给阳性克隆造成的不利影响：增加阳性克隆的得率.方法，加药后，在高倍镜下，阳性克隆和阴性克隆很简洁分辨，在阳性克隆下用记号电做个标记。之后：套环法（结合有限稀林法）：用套环套住阳性克隆，在套环内加胰蛋白酶或EDTA消化，把消化液吸到另外一个新的孔中培育。圾终再用有限稀糅法把阳性克隆在96孔板中筛选。刮除法（结合有限稀释法）：刮除阴性克隆，消化阳性克隆后接着筛选培育。最终再用有限稀释法把阳性克隆在96孔板中筛选，6、鉴定之后一般经过4周左右的解选，得到的阳性克隆都比较稳定.但是外源基因假如没有整合到基因组中的话，目的基因还是很简洁丢失的.但是外源基因整合到基因组中的概率太小了，而且是随机整合，会导致表达的目的蛋白的量产生很大差异.随着培育时间的持续，那些丢失了外源基因的细胞和很少表达目的基因的细胞会占据优势，强表达目的蛋白的细胞会越来越少。这样再次筛选是必不行少的只有经过2次以上的筹选之后才能找到那种我们想要的强分泌目的蛋白的，遗传植定的细胞克隆。细胞克隆有限稀狎法有限稀释法采纳样变倍数稀释的原则，将稀释的细胞悬液接种r微孔培育板中（也可在板上的96孔中干脆稀粹）培育肯定时间后，孔中可出现单个细胞克隆。本法不需特别设备，操作简洁快速，适合大大批量克隆化培育。现已广泛用于异成性细胞系的克隆化培育、诱导和分别，如耐药性细胞株或高转移性细胞株或突变细胞株以及单克隆抗体杂交痛细胞株的克隆筛选中。取对数生长期的细胞制成悬液（贴壁细胞用0.25*胰蛋白的消化后吹打分散制成），经台盼蓝染色计数，测定活细胞数及浓度（细胞存活率及单个细胞百分率应高丁90%以上）。将细胞悬液在试管中稀择，用培育基将细胞稀释至50个/ml、10个/ml、5个/ml,将3种稀择度的细胞分别接种于96孔板中，每孔100l,于37C、5%CO2下培育。次日在倒电显微镜卜.视察培育板各孔中的细胞数，选择只含一个细胞的孔，做好标记并补加100国培育基接着培育。培育期间，视PH值的改变确定是否换液或补加培育基，1周左右，孔中有明显克隆出现。待克隆长直孔底面的"3-1/2时,可用消化法将96孔板中的单一克隆的细胞分别移至24孔板中进行扩大培育.
