一代测序峰图说明.docx

一代测序的常见问题Sanger测序仪简介Sanger测序仪可一次接受1个96孔板。包括标识DNA片段的每排8个样品（样品设营）自幼变性，接若被毛细管电泳分离.每次分商之后,在8根毛细管中的可替代媒介（分寓胶）都被自动替代.分离胶是由一种轻易替代的胶管供应的，它能有效的供应1块96孔板。检测是在四个光谱信号中由激光诱导的荧光决定的.四色染料标识终止反应试剂盒用于对样且进行碱基序列分析.染料标识引物则用于对样品产生的片段长度进行分析.分寓之后，8根毛细管中的每根产生的原始数据信号都自动处理产生高质量的碱基序列或片E殳序列.原始数据和分析数据储存在数据库里，都可以以与一股分析应用程序兼容的格式输出.三收费状况1质粒和菌液I<»140GTGACUGTCTTiATT741.tCCAOTCCCTA1XCCGT洪序或功（收覆）2per测序恬殊结构（收费）谏序成功（收症）三数据分析1）引物之后的20bp甚至SObp之内的序列是不精确的，这重要是由于残存的染料单体导致的干扰峰所致，该干扰峰和正常序列峰里修在一起；此外，测序电泳开始阶段电压有一种除定期.2）序列末端轻易产生N值，峰图狡杂。由于测序反应的信号是逐渐减弱的,因此序列末端的信号会很弱.峰图自然就会杂S1.,加上测序胶的辨别率问题，假如同基分不开，就会产生N值.3）毋个测序反应会提供两个成果,一种是序列，一种是峰图；序列可以用Word,写字板等软件打开，峰图可以用Chromas软件及其他综合性软件打开.4）常见异常峰图及其分析峥图是以4种颜色持续的峰型图代表A、T、G、C4种碱基序列的图。峰的高下阐明了信号的强弱，宽窄表达的是分陶效果，可以对比板胶电泳的亮度和条带的宽窄.垂兼则阐明了样品中有长度相似不过序列不一样的片段。读长：序列读取的碱基长度，峰图上方横向显示的数字.信号：测序序列是通过对不一样碱基所携带的不一样颜色的荧光信号翻译所得，荧光信号的强弱是我们常说的信号1）也许原因一：模板中有碱基缺失，往往是单一位点或两个位点碱基缺失导致测序成果移码.处理措施：将PCR产物克隆到质粒中“摩克隆测序，或将PCR产物进行PAGE纯化后再进行测序.2）也许原因二：PCR产物不纯，含部分序列一致的两种以上的片段，长度不一.处理措施：市要原因是PCR产物没有纯化，具有部分序列一致的两种以上长度不一的片段，将PCR产物进行PAGE纯化后再进行测序.3）也许原因三：测序引物有碱基缺失，其和模板的威基缺失有些类1以，所不一样的是模板碱基缺失Ts是在一段正常测序序列后才出现移码，而引物碱基缺失的话，则从测序一开始就出现移码，表目前图形上便是一开始就是严击的峰形面1.crUU-ararSacaaryroaacttc*gcrto*e*c«cc<ccaa»r处理m施：至新合成引物，或将引物进行PAGE纯化.2、克隆测序时出现除形重修也许原因：所挑选的重组子不是单克隆，所提供的测序用质粒中具有两种以上插入片段不一样的质粒；或是送测序的菌液污染.处理措施：更新挑单克隆的菌落,提质粒或送菌液再次测序.3、po1.yA/T和C/Gc1.uster导致的套峥和汉师信号衰减也许原因：RACE测序时常常碰到这种情形.在PoIyAZT构造之后往往出现移码、双峰、登蜂现象，而在C/GC1.USter之后往往导致测序信号的衰减或者直接中断.处理音施：使用反向引物对模板进行测序，测到该po1.y构造处，即可完毕模板全长的拼接.假如是较长的C/Gc1.uster,可以使用特殊的试剂盒进行测序.4、基因中具有反旬序列也许原因:样品中具有反豆序列导致的测序成果和po1.yA/T的成果同样,会导致Frame滑动,较短的反复序列会导致测序成果出现移码；而较长的反复序列会使定序信号衰减.cetf*cttttee<cerceee<cfeettett_处理措施：反向测序有时可以1稣J的通过反发序列区域（但不是一定都可以），通过多次的测序成果比对,拼接可以得到全序列成果.峥图常见问题分析:一般成功峰图的锋型：锋利，对称，无底峰,读长：可信范围在800左右bp.信号:正常，走势平缓下降.1正常Per测序峰图长片段翕要优化不小于800bp长片段PCR峰图ATJrGCTCCTC.*1°.GGCGGY.CCCTTATC*CAGaaTCJAg«G*TAACCGAAGA特性：峰图中某些位置双峰.K-egJ1.jtsIMtnIMATTCACTTCCTTATTAAAACGACATT”1"1.»it3缺失特性：从碱基缺失位宣出现移码.移码-底峰序列体现为主峰向左或向右移动后的序列.CC«CCC«CTCTe«AACVACT6«ATCCCCCCCCVC<CGCCCAT*TCYTA*<6CC<<TTATCCCCTACTCAAA6M三三三H三W三三117底峰不洁净特性:信号图中基线不齐或信号弱也许原因:模板纯度不好,有杂质;模板呈偏低或反应进行不充足*Iaa1.a?Ckft»«*C1.1.TkCttA1.Va<C*&a*<I*fka1.*M?7a<1*I1.IaT«4UUa处理措施:加量电做或里送样8引物蜂及引物二聚体峰特性:在20-30.40-60bp碱基处有高信号的峰形成之后信号也许衰减.处理措施：*新合成引物或更新设计引物测序。引物峰引物与模板无结合位点引物二聚体蜂引物形成二聚体致使反应无信号或信号减弱9干扰峰（斜4峰）和酒精峰特性：4个干扰峥固定出目前30、40、70.IIObP附近至笠余g/、Ci.'、T4个IMiS1.>yeut立于卅ICC去以内.闺i任小才合曲消*奇二十位-f*2oo-3oo3冬之v>.iH月g”处理措施:电新3!呼10降解蜂特性:在220、45ObP附近G碱基降解,峰型扩散.处理措施:若不影响轴基判读不安排调整,否则安排宙新测序11反豆序列特性:单碱基或两个以上碱基反复出现,导致后续峰图也许移码或乱峰处理措施:因反复未测到的序列,提议加测反向辛加:r;:crc?c"f«rcicic6m。T:&tc:c:'i"isc:CIGrr1.gtg:g:Gfc,rsr(:«rc:G丁一12而GC特性序列局部碱基GC富集之后也许信号衰减（无信号）峰图变乱.GTT构造特性:序列局部碳基GTT常集,之后也许信号衰减,或无信号.MfACCVICCICV6CGV41u4t4?0reaACCcccTcgct*ccaccctctcgaaA-GCCIGCCCC66CGCNCCNVMNHftftVM4C1.ANV61.VYCNNGGNCCNCVMMO70Mt9”5105211aaccTccicvccciftcCTCCCCCGcCCGcccccTCCatATCftCTacvcaafccccccccccvG峰不正常ux,三*4»1490CCTA1.CCT*S*<CCTttJ1.i3。aatatcTCCGTCiceatcctcctcccatoav>M人加加,戏AyWMOCGMY13钉子峥也许原因：毛细管内有气泡，灰尘，和尿素结晶等，反射激光信号高，且是全波长的，因此四色荧光并存.14无信号特性:峰图体现为杂乱无章.形成原因:引物和模板不能正常结合反应,包括漏加,加错,有影响结合或影响反应原因处理措施:菌液用通用引物测无信号的安其浦斯摇菌、自带引物无信号提议通用引物测序;质粒、per测序无信号的不调能提议客户重新送样,若失败较多的挑几种重测,并跟客户阐明状况.CGGGGCCGGTTmUCGAEGTS*AK*TC4CCCCCTTCAGTCCCCATTAATGCCAA4C«iCTCTCTTCACTT二.二三一二二二ms'TT4TTCCCTC*TTGTTCTCT«CT*CCISTTCTCCTT4TTT*44cccct.rfcccck*ccCTC11*»CC4c如怂处曲武乂城小如思版（赢二确桃,