白鲜内生菌产生有效成分的能力.docx

白鲜内生菌产生有效成分的能力前言W.全株“将殊的忸做性气味，为多邠生点机帕统以干俅根皮入M,中药名为门鲜皮.真牙清热燥湿往华止料以及解冷等电安药理作用，用以治疗的水淋漓，湿存，黄泌乐赤，|门鲜的主要化学成分包括生物减类、拧愫苫4类、册体类.存亚索及费用类.挥发油臭、,fttt(U1.:中国Z比202m白鳏粗多傅，fKT<.K荷多以及侪半防J类化合物.K中以门典城.令剧及黄柏剧这:fftmmm*虞升丸£艮，故汕.种活建成分作为研究曳点其K柏IW可使昆虫产生拒食行为.塔落具有抑制微管作用的抗肿楹药的活性；门鲜班具有很好的体外抗直痢性,抗柚母和体外湿赤以及体外抗短活性等多种生物活世博崩不仅具有体外抗癌活性，还是治疗肝病的新金药物.I近些年来对植物的内生.值的研究越来超被国内外期究者所关注.I内4：1»(endophyte)是指在凡生活史的定阶段或仝郤价段生活TIy次M物的各种制织、»盲、援胞间即或如里内.MISk从f1.”次中卜斯”冬WHH9fMWMHI1.hZriA+84W内川大学对桃物讥况没有引起可显ASJf拄状的微生物,它包括绢通、rt放找M也包括那些生活史中某一阶段表面生的拿生曲，对宿主何时没行伤出的潜伏性病吼曲和曲根及收生苗等据不完全统计,性球的维生物总M“9.9M种.故人类认识到的丸供不住7力帆臼从1989年f1.现发审中首次分离得到植物内生M以来.忖起了大做关于内生阳的研丸.IAIn从各种经济林木英如云杉、冷杉以及桂树的树皮及枝叶内、从多种落水、草本机物、以及多种1培作物扎至是藻类但物中也发现:多种内生1次据统it，近年来人类发现的内生贡南171M,涉及到子货也、担子将接合俏、期角以及有影分裂小子H值及其无电曲等乡个种类对于一种植物从中分离得到的内生在第及内4：细能通常为数肿至致r种.例如部公候中共分高得到前株614株.其中根分附得到307株.H分离者到270株.叶分满布到37株：还有银杳中共分展得到159株,其中根分岗的到72株.找分离得到55株，叶分离得到32株;以及从杜仲、连翘.M仃巧等植物中均有分离得刎影j内生曲,可见内生前分布的普哥性以及物种的乡样tt.经历逐步深入的研究发现许多植物的内生能其行活性成分,*，34中的分阖解到的内生.蔺分离得到的其西共勿抗稻a鹿的活惧酊:柒怒奥水中分离福到的内生菌含有罗岔吐依以Mft(U4:vr1JIMrtrfrMWW他裁2005*ttus:ttU61：?1¾>MtrtV：c以RM'H'MtftW亢as(U7)1M!MnW.WMHtt.Hft及夫公.平境1»提笠活性物质.I以及木豆的内生等具有跟好的抗化活根我国等研允人员在4种先国的药用tfi用中分阳的内生曲也R有杭瘠以及抗像的正悄.内生阿生州产生-系列具/MkM1.：H*,SftM,1.AH'IR他七分离奖定“什内比白倩的分离生亢偏冷分寅落定除!R第内生偏分离笠定以取代串AWUMwnnf1.ftf1.tit(U1.O)：RohrtuCrr.ctc*11or*4kindandprecursord<1.r*op<ndd.ISPfoKEtr,eMopc幻c040biedfromDWWrhmDnectartktVEHofMAmooQ付Mu“mb)Mgh1.&Amftft(U1.1.):IntiiroenhmdMitr¼bm4nd11bcMdmenr",<xim<cjinHegZordcwh>cWrco"oow,oierajop<Iuys"oaaocpe313W3M*1.)M3Stft(U12:(11<k1.rtcFungiwthJrO-EentM".OnIbanCerxx1.>MneKtMttw*w1.cdIbMmcdicha1.(4m)u方生物活性的的次生代谢产物，并能够产生与空主植物相同或相似的药用活性的成分，I内生不仅是潜在的抗辄化剖资源史有良好的开发应用前景和就要的医药应用潜力。1.一AtWE1.Ii-HMn*FF<<101E白鲜药材以根皮入药不仅生.K年限长.而且我接我坏柿楂.而HH前对于白蟒的研究上要如ddM(¾*集中在化学成分、药理活性等方面.时药用活性成分单体的制番研究较少.所分腐都到的具石药用价位的门好化学成分花门鲜M出粉中含R低.并H结构更杂,化学合成至今做未成功.只候通过从白鲜等药用小拗的根'茎.叶中提取，但其效率低,成本而限制了对于白鲜化学成分的深入研完和应用对于臼蚱化学成分的提取,若采用传统的化学方法，其刷产物多，而H杏及对环境造成河染.对费源造成浪费.相反内生弧的象箱周期如.对环境要求比植物整低的多并且可以大批珞养.井H内生菌具仃很好的应用前冢.本试验格计时臼解内生苗的是否有生物活性进行研究，研究站!R将用明白鲜内生菌中是否有白鲜破、杨雳以及黄柏阳殍活性成分成衣合成其仃效成分的前提均版.AS少门鲜好生资源消耗.为我国的中药,医药保牝心等行业提供优质的原料I为可以快速大过得到白静碱、移用以及黄柏倒提供实收材料知理论侬据.I材料与方法1.1 材料1.1.1 1.1.供试材料白鲜桢保来却1.1.2 熔如"烫«IIHHI1%bkICie1.iiirrmMim成分W3勺簿跛鞘格。里<PDA)½HW2J.<q¾>g.WH3>.雳懦水1.CmJ外半球联辂并祝INA)鬣臼腮IO.NQSa牛肉自粕3和«：»15«.彩馅水100Dm1.K加总£1雄界亚福从货门卷5和KHiPO.IJ,曲SgTHQ1.a笥内循10小显将JKO1.£.6加收虹0033g.地师I85g.薮馅水IODOinI麦芽初育培办N穆麦不没再在薪情水中充分洛解.ifiiia.调至pH=41Q分装,1.21.VXiISmin我氏粒断珞并基<C71ANaNO3.0g.Mg7H:OaSgKHPOa1.t1.g.FeSOrTHXXtOIKC1.OSg.琼曲I5g.tf?W30g.鼓施木KKDm1.1.1.3 KM及仪01.2 内生的分离培养121消等射偈及消S度以内生苗分隔过程中用次S«Wtrt作为表面酒僚制分别.并设定不同的时间标度(ImiIK3min、5min.7min和浓度梯度5%、10%、20%、30%),用卬记法检给表面酒事效!R.在251'的培群箱内培养510天.配察培养基表面印记,以印记上不出现杂苗的坡低杀商浓鹿为表面灭曲的足隹条忤，122内生分育、培养及保存格洗好的白鲜粮和叶在超净工作台中用无前水冲洗3次,取主极切成为2an的小段.将处理好的样A8进行加卜过的：在无曲操作台中用75%乙的探洗20-4：无曲水冲洗4次：叶片用10%NaC1.O(vv)溶液淙洗3%根用20%NaC1.O(vv)海洗3min：然后用75%乙静源洗2O3Os;再用无菌水冲洗4次:将处理好的叶片月I无菌泡板吸干水分，用打孔器在每片叶片上M机打取】0个样丛,摘种干96的不同的培养她上(表I).将处理好的根用无他泡纸吸f.用无的广木刀切成Smm×5mm1.mm的小块楂种于9e的不同培养基上.23t下易光培养，M天.丽Ii培养,根如落落的形态特征和外观分鹰出单一的、特定的画落.酒后将这些的落在叙的PDA或NA培卷¥1.纯化培郎,进一步分团伙加通菌株井筑弓,保存时，神纯化培养后的IW株接种乳舒面上，25匕培养.3-5个月内转接一次,以偷保的株的活性.13对服药材溶液制备取对照药材粉末I小加甲醉20m1.超声处理30min.能过.滋液鼐干.残液加甲髀Im1.快活斛，作为对照药材溶液.1.4 对照品溶液制备取门鲜球.林朋和黄柏例对9M,加甲解制成剂Im1.含Img的溶液,作为对照治涔液.1.6 再层色谱法展开条件的脩选1.61 石油*乙乙(7:3)«ttIUMfcM'V''->M,VU*If；V徐"MeH>照薄层色谭法中国为小2010年版部附录V1.B)试验,吸取上述港液答5M1.分别点于RG带层板上,以石油Ie-乙酸乙酩(7:3)为网开剂.怅开.取出.踪干f1.101.乙酣，在IoSU加热至理点显色消斫；再由磷化铅钾溶液至斑点显色击fi.1.62 石油*乙乙(10:6)限薄层色设法(中国药典2010年版部附录V1.B)试验,分别吸取上述溶液85W”分别点于同一硅皎G薄层板上，以石油施尚酸乙ifi(10:6)为屣开剂，展开，取出，K,用Ig磕假乙肝必色,UOC供至加点显色清晰，再晞碘化阚？溶液至座点显色渊j.I/W0WH.-.臼付皮itt1.63 石*乙乙(1:1)/Mkm«e>e»wa>»j«ftKa».km0w'何大学&街开S«tH中心.广«810405)ME1.Uin*!1.t!fn!.Vd1.'.2015牌对照品和马材以及提取液口与-哦硅放G傅层板,展开条件石油雁(60DOU):乙酸乙用(1:1);显色剂:365nn波长处观察关光斑点;能吞草倏浓俄检呼客显色.】050热网吹至弱点是色清晰.I1.6.4甲紫-甲-»”(10:0.5：ai)懈薄层色谓法(中W药典刈。”版MIWVB)试蕤,吸取各种溶液51.分切点FR-硅胶GJm薄层较上，以甲末-甲静.冰窗酸(KM)$:0.”为展开剂，上行展开8Sb,取出.Ie干,喷10%的碇强乙醉的液,WUoS1.C烤粕中加慈3min,于365rnn条外灯F观能再喷10%硫酸乙酹.加热至段点显色清晰I用化饱钾溶液至斑点显色清麻1.65甲单环己建乙乙(3:3:3)年用薄层色设法(中国药典刘。年版部附录V1.B)试聚.用定性Ea1.代适敬吸取hi供试品溶液、对照跖材溶液、对照片溶液点与同硅胶G薄层板J展开条件为甲尔环己炕.乙敌乙南(3:3:3)展开，取出，I府I.Zrf紫外365nm)卜也察荧光.蝌;咬以5、香草作St酸试液.(f.105T加拄至如点显色清晰.再够碘化彩伸溶液至斑点显色消晰.供试师色谱中.,色M用底的史置上,能相同傲色的斑点.检测提取液内仃尤口舒时.黄柏IH以及移胴JKU1.阵中UH¾AmoIig中&饮片1.6 株初母1.6.1 .ItNTMHI对上逑褥到的或商用打孔蹲取】5个曲僻，荫尊而朝下，可五个两柄放于一个PDA培养用中培养7-10天待其偷蛉长洪培笄I1.T时,创取值纥于淀纸上？I于28-30掇氏度的烘箱中H1.24小时,将干燥后的微蛙置于2m1.离心管中.加入甲呼1.5m1.超声被提取40r.2h),超声后于痛心机6000r、7min*将上层液体用移液怆转移至新的飕心帝中作为供试品沼液.1.62IB层色,法母论施采川薄层色调法(中出药也2010年版部附录叫B)试龄.一定性毛编管适It吸取上述供试品溶液、对殖筠材溶液，对解品溶液点与同口胶G薄层板匕底开条件为甲笨环己烷乙酸乙南(3:3:3)展开，取出，晾干，Zt紫外36SnE)下以察荧光，燃后喷以5、杏率嵌硫敌试液，在IOS1.C加热至斑点显色沽新，再映碘化能划溶淞至斑点显色消蜥，供试品色谱中.在&对解&色诏相应的位置上.显相同颔色的加点.检测提取液内有无白舒即、黄柏阳以及格胴.1.6.3 Im姑果取©计跳各对照丛的Rfift,以及我光创点颜色